分光光度法测定燕麦β-葡聚糖含量

张 如 戴巧玲 吴小燕 李琳琳 陈元胜 吴 佳

(福州大学生物科学与工程学院，福州 350116)

分光光度法测定燕麦β-葡聚糖含量

张 如 戴巧玲 吴小燕 李琳琳 陈元胜 吴 佳

(福州大学生物科学与工程学院，福州 350116)

采用紫外可见分光光度法研究了刚果红浓度、β-葡聚糖浓度、反应温度、pH值、反应时间、离子浓度、光照、体系中可能共存的淀粉和蛋白等因素对测定燕麦β-葡聚糖含量的影响。同时，在紫外吸收光谱分析的基础上运用化学计量学方法计算刚果红与燕麦β-葡聚糖的结合常数K与结合位点数N及平均结合数n。结果表明：室温条件下，刚果红质量浓度50 μg/mL，pH 7.5，反应时间30 min，离子浓度0.1 mol/L时，吸光度与β-葡聚糖浓度在0～10 μg/mL范围内具有较好的线性关系。光照对测定无影响，共存的淀粉和蛋白质对测定影响较小。在试验条件下，刚果红与燕麦β-葡聚糖的结合常数K为4.08×106、结合位点数N为336、平均结合数n为297。

燕麦 β-葡聚糖 刚果红 分光光度法 结合模型

(1→3)(1→4)-β-D-葡聚糖，简称β-葡聚糖，属于水溶性膳食纤维，是由D-葡萄糖以连续的β-(1→4)糖苷键和单个的β-(1→3)糖苷键连接而成的线性多糖[1]，β-(1→4)键与β-(1→3)的比例约为7∶3，β-葡聚糖主要存在于燕麦、大麦等谷物中，并以燕麦麸中含量较高，是燕麦中重要的功能成分。研究发现，燕麦β-葡聚糖具有多种生理功能，能够降低胆固醇水平，预防心脑血管疾病，具有调节血糖，改善便秘，调理肠道等功能[2-5]。因此，研究人员对燕麦β-葡聚糖的提取、含量测定和结构性质等开展了大量的工作。

目前，测定β-葡聚糖含量较准确的方法主要是酶法和流动注射(FIA)荧光法[6-13]。但是酶法需要用到昂贵的高纯度专一性酶，检测时间较长。流动注射荧光法需要用到昂贵的仪器，需专人操作。因此，这2种方法都难以广泛应用。据报道，刚果红可与β-葡聚糖专一性结合，使溶液颜色加深[14-15]。利用这一原理，本研究以紫外可见分光光度计为检测仪器，定量测定燕麦β-葡聚糖的含量，对测定条件和方法的准确度与精密度进行了研究。并运用化学计量学方法计算刚果红与燕麦β-葡聚糖的定量结合规律。

1 材料与方法

1.1 主要材料

燕麦β-葡聚糖标品：百特纯大分子科技有限公司；刚果红：上海晶纯生化科技股份有限公司，ACS级；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

CARY50 Bio紫外可见分光光度计：美国瓦里安公司。

1.3 试验方法

1.3.1 溶液的配制

燕麦β-葡聚糖标准溶液的配制：准确称取0.010 0 g β-葡聚糖，加去离子水，80 ℃水浴搅拌溶解，冷却至室温后定容至100 mL，摇匀，即得到0.1 mg/mL的β-葡聚糖标准溶液。

刚果红储备液的配制：准确称取0.050 0 g刚果红，溶解于0.1 mol/L、pH 7.5的磷酸盐缓冲液中，定容至250 mL，摇匀，即得0.2 mg/mL的刚果红溶液。使用时，配制成所需浓度的刚果红溶液。

淀粉储备液的配制：准确称取0.315 8 g可溶性淀粉，加适量去离子水，5 min内加热至沸，煮沸15 min，快速冷却至室温后定容至100 mL，摇匀，即得3.158 mg/mL淀粉储备液。使用时，配制成所需浓度的淀粉溶液。

蛋白质储备液的配制：准确称取0.315 8 g酪蛋白，加10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，搅拌溶解完全后加10 mL 0.1 mol/L HCl中和后定容至100 mL，摇匀，即得3.158 mg/mL蛋白质储备液。使用时，配制成所需浓度的蛋白质溶液。

1.3.2 测定波长的确定

向试管中加入一定体积的燕麦β-葡聚糖标准溶液，用去离子水补至2 mL，加入4 mL一定浓度的刚果红溶液，得到不同浓度β-葡聚糖和刚果红的混合液，立即涡旋振荡10 s，静置30 min后用紫外可见分光光度计对混合液在350～700 nm进行吸收光谱扫描。并将混合液吸收光谱减去相同浓度刚果红溶液吸收光谱，得到两者的差谱。混合液中各组分浓度均为溶液中(共6 mL)的终浓度。试验均做3次平行，后续试验如无特殊说明，操作过程与此相同。

1.3.3 刚果红浓度与β-葡聚糖线性范围的确定

配制系列混合液，使其中刚果红质量浓度为30～70 μg/mL，β-葡聚糖质量浓度为0～30 μg/mL，于550 nm处测定吸光度。试验以相应浓度的刚果红溶液为空白。

1.3.4 测定条件的影响

所有测定的混合液中，β-葡聚糖和刚果红终质量浓度分别固定为8 μg/mL和50 μg/mL。

反应温度的影响：配制混合液于5～50 ℃条件下静置30 min，在550 nm处测定吸光度，以相同反应温度的刚果红溶液为空白。

离子浓度的影响：配制浓度为0～0.2 mol/L，pH值7.5的磷酸盐缓冲液，将其作为溶剂配制刚果红溶液。在550 nm处测定混合液吸光度，以相应离子浓度的刚果红溶液为空白。

缓冲液pH值的影响：配制0.1 mol/L pH值为6.0～8.0的磷酸盐缓冲液，将其作为溶剂配制刚果红溶液。于550 nm处测定混合液吸光度，以相应pH值的刚果红溶液为空白。

反应时间的影响：配制混合液静置0～60 min，在550 nm处测定吸光度，以相同浓度的刚果红溶液为空白。

淀粉的影响：向混合体系中加入淀粉储备液，使其中淀粉与β-葡聚糖浓度之比为0～100。于550 nm处测定吸光度，以相同浓度的刚果红溶液为空白。

蛋白质的影响：方法同淀粉的影响，蛋白质与β-葡聚糖浓度之比为0～100。

光照的影响：将混合液分别在正常光照与避光条件下静置30 min，在550 nm处测定吸光度。以相同条件下的刚果红溶液为空白。每组均做5次平行试验。

1.3.5 精密度和加样回收率试验

精密度试验：方法同1.3.4光照条件的影响中正常光照条件组。

加样回收率试验：取1 mL适当稀释的燕麦麸皮水提液，加入0～0.48 mL的燕麦β-葡聚糖标准溶液，用去离子水补足至2 mL，加入4 mL刚果红溶液，于550 nm处测定吸光度。以相同浓度的刚果红溶液为空白。

回收率=(C-A)/B×100%

式中：A为燕麦麸皮水提液所含β-葡聚糖量；B为标准β-葡聚糖加入量；C为加入标准β-葡聚糖后水提液所测β-葡聚糖量。

1.3.6 刚果红和β-葡聚糖结合模型

ΔA=A-εFCT

(1)

Δε=εB-εF

(2)

n=ΔA/(ΔεCG)

(3)

ΔA=Δε(1+KCT)/K-ΔεN(CTΔε/ΔA-1)CG

(4)

式中：A为刚果红与葡聚糖复合物的吸光度；εF为游离刚果红的摩尔吸光系数；CT为溶液中刚果红总的浓度；εB为结合到葡聚糖上刚果红的摩尔吸光系数；n为平均每个β-葡聚糖分子上结合的刚果红分子数；CG为溶液中β-葡聚糖的浓度；K为结合常数；N为溶液中每一个β-葡聚糖分子上的总的结合位点数。

式(4)中，ΔεN是一个常数，Δε(1+KCT)/K是与试验中所用刚果红浓度有关的常数。以(CTΔε/ΔA-1)CG为横坐标，ΔA为纵坐标作图，可得一线性方程。通过该线性方程的截距与斜率可求得结合常数K与结合位点数N。

2 结果与分析

2.1 测定波长的选择

图1中刚果红质量浓度为50 μg/mL，β-葡聚糖质量浓度为8 μg/mL。由图1可知，混合液的吸收光谱与刚果红溶液的相比，发生了明显红移，在480～600 nm范围内吸光度明显增加。由两者的差谱可以看出，在波长550 nm处存在吸光度的最大差值。试验发现对不同刚果红浓度，不同β-葡聚糖浓度混合液测得的吸收光谱，与相应浓度的刚果红吸收光谱比较起来，均在550 nm处有吸光度的最大差值，表明该波长处灵敏度最高，故选择550 nm为测定波长。

图1 吸收光谱与吸收差谱

2.2 刚果红浓度与β-葡聚糖线性范围的确定

2.2.1 刚果红浓度的确定

由图2可以看出，在一定浓度的刚果红溶液中，随着葡聚糖浓度的增加，吸光度逐渐增加并趋于平稳。含较高浓度刚果红混合液的吸光度曲线位于含较低浓度刚果红混合液吸光度曲线的上方。为了实现定量测定，需要利用吸光度曲线的线性增加部分。经过比较发现，当葡聚糖质量浓度在0～10 μg/mL范围内，混合液的吸光度大致随葡聚糖的浓度呈线性增加的趋势。在这一线性范围内考察，对于相同浓度的葡聚糖溶液，当刚果红质量浓度从30 μg/mL增加至50 μg/mL时，吸光度有所增加。进一步增加刚果红浓度，混合液吸光度基本保持不变，吸光度曲线接近重合，可认为此时β-葡聚糖上的可结合位点基本都被刚果红分子占据，因此当刚果红质量浓度大于50 μg/mL时吸光度不再增加。不同刚果红浓度下，葡聚糖质量浓度为0～10 μg/mL的线性拟合曲线的斜率见表1，由表1可见当刚果红质量浓度大于50 μg/mL时回归曲线的斜率基本保持不变且维持在0.031左右，说明在此浓度时测定的灵敏度达到最大且基本不再随刚果红浓度而增加。综合考虑选择刚果红终质量质量浓度为50 μg/mL。

图2 刚果红浓度对复合物测定的影响

刚果红质量浓度/μg/mL3040506070葡聚糖在0～10μg/mL范围斜率0.0210.0250.0310.0310.032

2.2.2 β-葡聚糖线性范围的确定

将图2中50 μg/mL的刚果红吸光度曲线单独绘制，如图3所示。由图3可以看出，复合物的吸光度与β-葡聚糖质量浓度在0～10 μg/mL范围内有较好的线性关系。

图3 β-葡聚糖质量浓度对复合物测定的影响

2.3 测定条件的影响

2.3.1 反应温度的影响

由图4a可以看出，随着反应温度的增大，吸光度呈现先稳定不变后减小的趋势。其中5～35 ℃时，吸光度基本稳定；35 ℃以上，吸光度显著减小。推测反应温度高于35 ℃时，刚果红分子与β-葡聚糖之间的氢键作用力遭到破坏，不利于复合物的形成。考虑到实际的实验情况，反应温度选择在室温下即可。

2.3.2 离子浓度的影响

因图4b采用对数坐标，故不包括离子浓度为0时的吸光度0.020。可以看出，随着离子浓度的增加，吸光度先显著增加然后明显减小。当离子浓度达到0.05 mol/L时，吸光度达到最大。离子浓度0.1 mol/L和0.05 mol/L时的吸光度基本相等。离子浓度较小时，因为少量带负电荷的刚果红分子与β-葡聚糖结合使β-葡聚糖分子带负电荷，影响了更多刚果红分子结合到β-葡聚糖上，所以此时混合液的吸光度较小。随着离子浓度的增加，部分刚果红分子的负电荷被屏蔽，减少了刚果红分子与β-葡聚糖分子间的静电斥力，有利于更多的刚果红与β-葡聚糖结合形成复合物，故吸光度增加。当离子浓度过大时，刚果红分子负电荷被屏蔽程度进一步增大，促使其自身聚集程度增加，所形成的刚果红聚集体难以结合到β-葡聚糖分子上，减少了复合物的形成，故吸光度又减小。考虑到0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液缓冲能力较强，选择离子浓度为0.1 mol/L。

图4 测定条件的影响

2.3.3 缓冲液pH值的影响

由图4c可以看出，随着缓冲液pH值的增大，吸光度呈现先增加后减小的趋势。当pH值为7.5时，吸光度达到最大值。推测在该pH条件下，刚果红分子与β-葡聚糖能较好的结合形成深红色的复合物，故选择缓冲液pH值7.5。

2.3.4 反应时间的影响

由图4c可以看出，随着反应时间的增加，吸光度不断增加。其中0～10 min范围内，吸光度显著增加；10～20 min范围内，吸光度缓慢增加；30 min以后，吸光度基本稳定。推测刚果红分子结合到葡聚糖分子上形成复合物是一个动态过程，此过程达到平衡需要一定的时间，在试验条件下，经30 min基本达到平衡。故选择反应时间为30 min，以获得较为稳定的吸光度值。

2.3.5 淀粉的影响

因图4d采用对数坐标，故不包括未添加淀粉时的吸光度0.257。可以看出，当淀粉与葡聚糖浓度比值小于10时，吸光度基本稳定，比值大于10时，吸光度明显减小。这可能是因为在含较高淀粉浓度的溶液中，淀粉与刚果红相互作用，形成了类似碘与淀粉所形成的包合物，阻碍了刚果红分子与葡聚糖分子的结合，造成了吸光度的降低。但是，刚果红与淀粉间的结合作用较弱，因此，当体系中淀粉浓度较低时，对吸光度影响较小。由图4d可见，当淀粉与葡聚糖浓度比值小于10时，淀粉对测定燕麦β-葡聚糖含量几乎没有影响。

2.3.6 蛋白质的影响

因图4d采用对数坐标，故不包括未添加蛋白质时的吸光度0.256。可以看出，当蛋白质与葡聚糖浓度比值小于5时，吸光度基本稳定，比值大于5时，吸光度下降明显。这可能是因为较高浓度蛋白质溶液中，蛋白质与刚果红发生了结合，从而影响了刚果红与葡聚糖分子的结合[18-19]。当蛋白质与葡聚糖浓度比值小于5时，蛋白质对测定燕麦β-葡聚糖含量几乎没有影响。

2.3.7 光照的影响

因为光照可能会使刚果红分子发生顺反异构变化，从而可能影响刚果红与β-葡聚糖的结合，所以分别在正常光照条件和避光条件下进行对比实验。由表2可以看出，正常光照条件和避光条件下，在550 nm处5次重复试验的平均吸光度基本相同。因此，认为光照对测定燕麦β-葡聚糖含量没有影响。

表2 光照对复合物测定的影响

2.4 精密度和加样回收率试验

2.4.1 精密度试验

通过对同一浓度β-葡聚糖的多次测定来检验分光光度法的精密度。由表2正常光照组可以看出，5次试验结果重复性较好，RSD=0.78%，表明分光光度法测定β-葡聚糖含量有较高的精密度。

表3 加样回收率试验

2.4.2 加样回收率试验

通过对已知浓度β-葡聚糖的测定，来检验分光光度法的准确度。由表3可以看出，试验结果平均回收率为101.32%，表明分光光度法测定β-葡聚糖含量有较高的准确度。

2.5 刚果红和β-葡聚糖结合模型

图5 ΔA～(CTΔε/ΔA-1)CG×10-9

3 结论

室温条件下，刚果红质量浓度50 μg/mL，pH 7.5，反应时间30 min，磷酸盐缓冲液离子浓度0.1 mol/L时，吸光度与β-葡聚糖质量浓度在0～10 μg/mL范围内具有线性关系。光照对分光光度法测定燕麦β-葡聚糖含量无影响，较低浓度的共存淀粉和蛋白质对测定影响较小。在试验条件下，刚果红与燕麦β-葡聚糖的结合常数K为4.08×106、结合位点数N为336、平均结合数n为297。刚果红分光光度法测定燕麦β-葡聚糖含量有较好的精密度和准确度。因此，在一定条件下，刚果红分光光度法能较好的测定燕麦β-葡聚糖的含量。

[1]汪海波，刘大川，谢笔钧，等．改进荧光法测定β-葡聚糖含量研究[J]．中国粮油学报，2004，19(1)：70-74

[2]刘影，董利．燕麦的营养成分与保健作用[J]．中国食物与营养，2009，3：55-57

[3]Anderson J W．Plant fibre and blood pressure[J]．Annals of Internal Medicine，1983，98：842-846

[4]Anderson J W．Dietary fibre and human health[J]．Horticultural Science，1990，25：1488-1495

[5]Anderson A A M，Armo E，Fredriksson H，et al．Molecular weight and structure of (1→3)，(1→4)-β-D-glucans in dough and bread made from hull-less barley milling fractions[J]．Journal of Cereal Science，2004，40：195-204

[6]Hallfrisch J，Scholfield D J，Behall K M．Physiological responses of men and women to barley and oat extracts (Nu-trimX)．II．Comparison of glucose and insulin responses[J]．Cereal Chemistry，2003，80(1)：80-83

[7]涂杰，张新申，俞凌云，等．流动注射刚果红光度法快速测定谷物制品中β-葡聚糖含量的方法[J]．粮食与饲料工业，2009，2：46-48

[8]Switala K J，Schick K G，Griffith A，et al．Rapid determination of beta-glucan in wort by flow injection analysis[J]．Journal of the American Society of Brewing Chemists，1989，47(2)：54-56

[9]YunC H，Estrada A，Van K A，et al．Immunomodulatory effects of oat β-glucan administered intragastrically or parenterally on mice infected withEimeriavermiformis[J]．Microbiogy and Immunology，1998，42(6)：457-465

[10]McCleary B V，Codd R．Measurement of (1→3)，(1→4)-β-D-glucan in barley and oats：a streamlined enzymic procedure[J]．Journal of the Science of Food and Agriculture，1991，55：303-312

[11]Munck L，Jorgensen K G，Ruud-Hansen J，et al．The EBC methods for determination of high molecular weight β-glucan in barley，malt，wort and beer[J]．Journal of the Institute of Brewing，1989，95：79-82

[12]Rieder A，Knutsen S H，Ballance S，et al．Cereal β-glucan quantification with calcofluor-application to cell culture supernatants[J]．Carbohydrate Polymers，2012：1564-1572

[13]Wood P J，Weisz J．Use of calcofluor in analysis of oat beta-D-glucan[J]．Cereal Chemistry，1984，61(1)：73-75

[14]Wood P J，Paton D，Siddigui L R，et al．Determination of β-glucan in oats and barley[J]．Cereal Chemistry，1977，54(3)：524-533

[15]张娟，杜先锋，饶砚琴．刚果红法测定燕麦中β-葡聚糖含量的研究[J]．安徽农业大学学报，2007，34(1)：23-26

[16]Jiao Q，Liu C，Sun Q，et al．Investigation on the binding site in heparin by spectrophotometry[J]．Talanta，1999，48：1095-1101

[17]Wu J，Deng X，Tian B Q，et al．Interactions between oat β-glucan and calcofluor characterized by spectroscopic method[J]．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56：1131-1137

[18]詹国庆，罗登柏，谭祖宪，等．蛋白质与刚果红结合反应的研究[J]．分析科学学报，2004，20(4)：370-372

[19]马卫兴，钱保华，杨绪杰，等．刚果红与蛋白质相互作用的分光光度研究及分析应用[J]．理化检验化学分册，2005，41(7)：492-494.

Quantification of Oat β-Glucan by Spectrophotometry

Zhang Ru Dai Qiaoling Wu Xiaoyan Li Linlin Chen Yuansheng Wu Jia

(College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350116)

Spectrophotometry was used to determine the content of oat β-glucan. The effects of some factors were investigated, including the concentration of Congo red and oat β-glucan, reaction temperature, pH, reaction time, ion concentration, exposure to light, and the starch and protein coexisting in the system. The binding equilibrium constant K, the total number of binding sites per β-glucan molecule N, and the binding number of Congo red per β-glucan molecule n were determined by chemometrics based on the analysis of ultraviolet-visible absorption spectra. The results showed that the absorbency had a linear relationship with β-glucan in the concentration from 0 to 10 μg/mL under the condition that room temperature, Congo red concentration 50 μg/mL, pH 7.5, reaction for 30 min, and ion concentration 0.1 mol/L. Exposure to light had no effect on the determination. Starch and protein had a relatively low effect on the absorbency. The binding equilibrium constant K, binding sites N and average binding numbernare 4.08×106, 336 and 297, respectively under the experimental conditions.

oat,β-glucan,congo red,spectrophotometry,binding model

TS201.2

A

1003-0174(2016)06-0140-06

国家自然科学基金项目(31101224)，福建省自然科学基金项目(2013J05049)

2014-09-24

张如，男，1989年出生，硕士，食品工程

吴佳，男，1980年出生，副教授，食品化学