米糠油不饱和脂肪酸对HepG2细胞增殖的影响

梁 盈 刘 颖 鲁 倩 吴 伟 高 宇 田明慧 林亲录

(稻谷及副产物深加工国家工程实验室 中南林业科技大学，长沙 410004)

米糠油不饱和脂肪酸对HepG2细胞增殖的影响

梁 盈 刘 颖 鲁 倩 吴 伟 高 宇 田明慧 林亲录

(稻谷及副产物深加工国家工程实验室 中南林业科技大学，长沙 410004)

采用MTT比色法研究米糠油不饱和脂肪酸对HepG2细胞生长的抑制作用。结果表明：米糠油不饱和脂肪酸在一定浓度范围内对肝癌细胞有明显抑制作用，当米糠油和亚麻酸浓度达到0.15 mmol/L、油酸 0.2 mmol/L、亚油酸0.08 mmol/L以上时，抑制作用明显。细胞周期检测结果显示米糠油不饱和脂肪酸处理肝癌细胞后G2期细胞含量下降，发生了明显的S期阻滞。光镜观察结果显示，肝癌细胞呈多边形，轮廓清晰，核仁2～5个，细胞增殖旺盛，贴壁牢固，胞间连接紧密；而经米糠油不饱和脂肪酸处理后的肝癌细胞明显收缩变圆，胞体变小，细胞间隙增大，胞核模糊不清，部分细胞出现脱落，核仁外溢，说明米糠油不饱和脂肪酸体外对HepG2有显著的增殖抑制作用。

米糠油 不饱和脂肪酸 肝癌细胞 增殖抑制

米糠是大米加工过程中的重要副产物之一，是糙米在碾白时分离出的胚芽和糠层的混合物[1]。有数据表明，虽然米糠只占稻谷总量的6%～8%，但却有着整个稻谷64%的重要营养成分[2]。米糠也是一种很好的油料资源，米糠油的制取方法主要有压榨法、浸出法、超临界法等，我国主要应用的是压榨法和浸出法[3]。粗制米糠油中一般含有4%左右的不皂化物[4-5]，不皂化物中含量较多的活性物质有植物固醇(1.5%～2%)，谷维素(1.2%～1.8%)，生育酚以及生育三烯酚(0.15%～0.2%)[6-8]。米糠油中的不饱和脂肪酸含量比饱和脂肪酸多，其中单不饱和脂肪酸的OA(Oleic acid,油酸)和多不饱和脂肪酸的LA(Linoleic acid,亚油酸)占70%左右，且OA与LA 比例约为1.1∶1，符合国际卫生组织推荐的OA和LA比例为1∶1的最佳比例[9]。米糠油作为一种高营养价值的植物油，其不饱和脂肪酸含量与组成也有其他植物油不可比拟的优势。现在对于从其他植物油中提取不饱和脂肪酸的研究报道较多，但对米糠油中的不饱和脂肪酸报道较少。且目前对米糠油的功能特性及生理活性的研究主要集中在谷维素、生育酚等活性成分上，缺乏对其中不饱和脂肪酸的关注，限制了其开发利用[10-11]。近年来的研究表明，某些不饱和脂肪酸对如乳腺癌[12]、结肠癌[13]、前列腺癌[14]等癌症有较好的抑制作用，而米糠油蕴含丰富的不饱和脂肪酸资源，主要研究了米糠油不饱和脂肪酸对肝癌细胞HepG2增殖的影响，为进一步开发利用米糠油提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

米糠：金健米业股份有限公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；细胞冻存液：北京索莱宝科技有限公司；抗荧光淬灭封片液：碧云天生物技术研究所；人肝癌组织细胞(HepG2：Hepatocellular carcinoma cells)：长沙赢润生物技术有限公司。XDS-10型倒置显微镜：上海团结仪器制造有限公司；OLYMPUS IX71荧光倒置显微镜：日本奥林巴斯公司。

1.2 试验方法

1.2.1 米糠油的制备

经过课题组前期工作，已从米糠中提取出纯度高的米糠油并对其脂肪酸组成进行了测定，得到的结果如表1所示[15-16]。

表1 米糠自提米糠油的主要脂肪酸测定结果/%

表1(续)

1.2.2 HepG2细胞的培养[17]

HepG2在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，5% CO2，37 ℃条件下培养，隔天传代1次。细胞生长至3～5代处于对数生长期成单层时进行消化，开展试验。将储藏于-20 ℃的米糠油、油酸、亚油酸及亚麻酸放置于室温下使其成液体状。用少量体积分数70%乙醇将米糠油、油酸、亚油酸及亚麻酸溶解后与10% FBS-DMEM细胞培养液混合，配制成0.5 mmol/L浓度的米糠油、油酸、亚油酸、亚麻酸母液。充分摇匀，4℃保存，临用前再用培养液稀释成所需浓度的处理液。

1.2.3 米糠油不饱和脂肪酸处理HepG2细胞生长曲线的测定[18]

取3～5代对数生长期内且生长融合成单层的细胞，随机分为5组(正常对照组、米糠油处理组、油酸处理组、亚油酸处理组、亚麻酸处理组)。用0.25%胰蛋白酶消化液消化后以104个/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔200 μL，继续培养24 h。待细胞贴壁后分别换用相应培养液和处理液，继续培养24、48、72 h；至相应处理时间后，向各组细胞每孔加入20 μL MTS溶液，继续培养4 h，弃培养液，酶标仪490 nm处测吸光值(OD值)。分别测定0、24、48、72 h 4个时间点对应的OD值，绘制细胞生长曲线图。

1.2.4 米糠油不饱和脂肪酸处理HepG2细胞HE染色观察检测[19]

取3～5代对数生长期内且生长融合成单层的细胞，随机分为5组：1)正常对照组：加入普通DMEM培养液培养；2)米糠油处理组：加入0.15 mmol/L 米糠油处理液培养48 h；3)油酸处理组：加入0.2 mmol/L油酸处理液培养48 h；4)亚油酸处理组：加入0.08 mmol/L 亚油酸处理液培养48 h；5)亚麻酸处理组：加入0.15 mmol/L 亚麻酸处理液培养48 h。

将细胞接种于放有盖玻片的6孔培养板中，待细胞生长至对数生长期并融合成单层时按分组要求处理细胞。48 h后取出长有细胞的盖玻片，Bouin’s固定液固定1 h以上，70%乙醇脱色后，蒸馏水漂洗干净。苏木素液中染色5～15 min，流水洗去残余的苏木素液，分化液分色5～10 s后，1%氨水返蓝3～5 min，流水冲洗，梯度乙醇溶液脱水。用伊红染液染色1～5 min后，95%乙醇和100%乙醇中迅速通过以洗去玻片表面多余伊红染液。乙醇与二甲苯1∶1混合溶液中浸泡，中性树脂封片，倒置显微镜下观察细胞凋亡形态变化，并进行拍照。

1.2.5 米糠油不饱和脂肪酸处理HepG2细胞生长周期流式检测[20]

试验分组同1.2.4，取对数生长期细胞制成105个/mL的悬液接种于6孔板，每孔接种3 mL，贴壁培养24 h后，去除培养液，每孔加一定浓度不饱和脂肪酸溶液于培养箱培养。24 h后用胰蛋白酶消化并收集细胞，用冷的PBS洗2遍后再用1 mL PBS溶液重悬，1 500 g转速下离心5 min，去上清液。加入2 mL预冷的70%酒精，-20 ℃固定过夜，然后用流式细胞仪分析检测。

1.3 统计学分析

试验均重复操作3次。数据都使用SPSS统计分析软件(17.0中文版)处理分析，均数±标准差表示(x±s)。多组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，各组间两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著性意义。

2 试验结果

2.1 不同处理组HepG2细胞生长曲线测定

有研究表明，不饱和脂肪酸对癌细胞最佳处理时间在48 h为宜，处理浓度在0.05～0.20 mmol/L时，就能较大程度诱导癌细胞凋亡[21]。而试验一般选择IC50或者靠近IC50值的浓度作为处理浓度最佳[22]。

不同处理组的细胞增殖曲线(图1)结果显示，不同浓度的米糠油及不饱和脂肪酸处理组细胞与正常对照组细胞相比，细胞生存活力(OD值)均有所降低，并随着处理浓度的升高，OD值下降的趋势增大。米糠油处理组(图1a)在0.1 mmol/L时对HepG2细胞增殖的影响不大，当浓度增加到0.15 mmol/L时OD值约为正常对照组的56%左右。处理组细胞经处理后48 h内接近对照组细胞增殖能力50%时视为造模成功，而在0.15 mmol/L处理浓度下细胞存活率接近50%，故选取0.15 mmol/L为米糠油最佳处理浓度。同理从结果可以看出，油酸处理组(图1b)在浓度为0.2 mmol/L时，OD值约为正常对照组的57%左右，亚油酸处理组(图1c)在浓度仅为0.08 mmol/L时细胞存活率即降到50%以下，亚麻酸处理组(图1d)在浓度为0.15 mmol/L时细胞存活率下降至54%，因此油酸、亚油酸、亚麻酸的最佳处理浓度分别选定为0.2 mmol/L、0.08 mmol/L和0.15 mmol/L。

图1 不同处理组HepG2细胞增殖曲线

2.2 处理前后 HepG2细胞光镜下的形态变化

苏木精-伊红染色结果显示(如图2)：正常对照组的细胞具有肝癌细胞典型的形态特征，呈多边形、多角形等肝癌细胞的形态，大小均匀铺展开来，表面光滑，较圆。边缘清晰，呈单层均匀排列；细胞核呈蓝色而细胞质呈现红紫色，核质区别分明。细胞核处于细胞的中央，核仁清晰可见，颜色深，一般呈不规则的椭圆形。几乎每个细胞都能看到2～5个细胞核仁，说明细胞生长旺盛。而细胞质铺展，但看到红紫色染色不均匀，颜色深浅有些区别。从图片上还能明显看到部分细胞处于细胞分裂的状态(图2a)。米糠油、油酸、亚油酸和亚麻酸处理组中的细胞数目明显较少，细胞形态表现出损伤特征；细胞胞体大部分变小变圆，细胞团缩，呈极性状；核蓝质红仍可观察到，但核质不分明，细胞核变小，核仁不清晰且数目明显减少；细胞质皱缩、拉长，HE染色较深(图2b、图2c、图2d、图2e)。

图2 48 h不同处理组对HepG2细胞形态结构的影响(×400)

2.3 处理前后HepG2细胞生长周期的变化

流式细胞术测定HepG2生长周期结果如图3和图4。在G1期正常对照组、米糠油处理组、油酸处理组、亚油酸处理组、亚麻酸处理组细胞百分比分别为65.514、45.456、59.351、51.769、57.357，S期细胞百分比分别为31.939、53.242、39.251、48.231、41.318，G2期细胞百分比分别为2.546、1.303、1.398、0、1.325。G1期米糠油、亚油酸处理组与正常对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，S期与G2期各处理组与正常对照组比较，差异都有统计学意义(P<0.05)。各处理组G1、G2期细胞相比正常对照组减少，S期细胞明显增加，说明经过米糠油及不饱和脂肪酸处理后，细胞几乎都在S期被阻滞，进入G2期的细胞减少，细胞分裂的趋势明显降低。值得一提的是，亚油酸处理组无G2期细胞，细胞都被阻滞在S期，DNA二倍体变成四倍体的过程被停滞，对抑制HepG2细胞增殖效果相比于其他各组更好。

图3 48 h不同处理组对HepG2细胞生长周期的影响

注：*P<0.05 ,与正常组对照。

3 结论

结果表明：米糠油不饱和脂肪酸对HepG2有明显的增殖抑制作用，当米糠油和亚麻酸在0.15 mmol/L、油酸0.2 mmol/L、亚油酸0.08 mmol/L以上时，抑制作用明显，其中，多不饱和脂肪酸(亚油酸、亚麻酸)比米糠油抑制效果好，而单不饱和脂肪酸(油酸)的抑制效果不明显；经米糠油不饱和脂肪酸处理后，肝癌细胞活力显著降低，细胞形态与正常肝癌细胞相比发生明显变化，可以看到多数细胞已经凋亡或有凋亡的迹象；米糠油不饱和脂肪酸使HepG2细胞发生S期阻滞，抑制其增殖。

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Effect of Unsaturated Fatty Acids from Rice Bran Oil on HepG2 Cell Proliferation

Liang Ying Liu Ying Lu Qian Wu Wei Gao Yu Tian Minghui Lin Qinlu

(National Engineering Laboratory for Rice and By-product Deep Processing,Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004)

This paper mainly determines the inhibition of unsaturated fatty acids from rice bran oil on the growth of liver hepatocellular carcinoma (HepG2) cells. The results show that the inhibition ability of unsaturated fatty acids within a certain concentration scope from rice bran oil on HepG2 was obvious.When the concentration of RBO, linolenic acid, oleic acid and linoleic acid reached 0.15 mmol/L, 0.15 mmol/L, 0.2 mmol/L and over 0.08 mmol/L, respectively ，the effect of inhibition was evident. Cell cycle detection showed that the percentage of G2 phase cells was decreased and block in S phase appeared after HepG2 cells were treated with unsaturated fatty acids from rice bran oil. Result of light microscopic observation showed that cells were polygon,had clear edge and 2～5 nuclears in each cell with vigorous cell proliferation，and cells were strongly adhered and intercellular connection is closed; and cells were significantly shrunk, cell body became smaller, and intercellular space was increased, andnucleus became blurred following treatment with unsaturated fatty acids from rice bran oil; Additionally, cell membrane cell fell off in part of cells, and nucleolus overflew. On this basis, t unsaturated fatty acids from rice bran oil may significantly inhibit proliferation capability HepG2 cells.

rice bran oil, unsaturated fatty acids, hepatocellular carcinoma cells, proliferation inhibition

TS213.3

A

1003-0174(2016)06-0098-05

国家自然科学基金(31201348)，湖南省自然科学基金(13JJ4086)，湖南省农业成果转化(2013NK 4002)，长沙市科技计划(K1403039-21)

2014-10-13

梁盈，女，1981年出生，副教授，分子营养学

林亲录，男，1966年出生，教授，稻谷深加工