创伤后应激障碍大鼠海马星形胶质细胞Bax的表达

闫 帅 高崧淋 陈玉杰 魏垚臣 王海涛

华北理工大学临床医学院 河北唐山 063000



创伤后应激障碍大鼠海马星形胶质细胞Bax的表达

闫 帅 高崧淋 陈玉杰 魏垚臣 王海涛

华北理工大学临床医学院 河北唐山 063000

①目的 观察创伤后应激障碍(PTSD)大鼠海马星形胶质细胞凋亡相关蛋白(Bax)的表达。②方法 选用Wistar大鼠，随机分为对照组和模型组，使用单一连续应激(SPS)建立PTSD大鼠模型，采用激光共聚焦方法观察神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)与Bax在海马星形胶质细胞中的共存。③结果 模型组大鼠海马星形胶质细胞GFAP、Bax阳性细胞数和积分光密度均高于对照组(P<0.05)。④结论 PTSD大鼠海马组织星形胶质细胞Bax表达增加，这可能与PTSD发病机制有关。

创伤后应激障碍 海马 星形胶质细胞 激光扫描共聚焦

创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder, PTSD)是个体亲历灾难性事件或死亡威胁所引发的一种精神障碍。其核心症状之一是反复不自主的创伤性再体验[1]。海马是空间定位以及学习记忆功能相关的重要脑区。有报道PTSD等应激选择性的损害海马，致使海马组织体积缩小、功能减退[2]。中枢神经系统细胞90%为神经胶质细胞，其中20%为星形胶质细胞。星形胶质细胞可调节神经信号传递、诱导突触形成，同时为神经元提供重要的营养、通讯和保护作用，是连接神经元与神经胶质细胞的桥梁。星形胶质细胞已经成为研究神经科学的热点[3～8]。PTSD患者星形胶质细胞是否存在凋亡，目前还未见明确报道。本实验研究观察PTSD大鼠海马星形胶质细胞凋亡相关蛋白(Bax)和神经胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP)的表达情况，为PTSD研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物和分组 雄性Wistar大鼠20只(购自华北理工大学动物实验中心)，体质量200～250g，适应性喂养1周后，随机分为对照组和模型组，每组10只。饲养条件：12小时白天/12小时黑夜,(22±1)℃,(52±2)%湿度，换气通风，自由进食进水。鼠盒、饮水瓶、垫料和饲料都经高压消毒。每周两次更换垫料、消毒，隔周更换消毒剂品种，每月进行一次大消毒。

1.2 主要试剂和仪器 兔抗鼠GFAP抗体、鼠抗鼠Bax抗体、羊抗兔lgG/Alexa Fluor 488、羊抗鼠lgG/Alexa Fluor 647均购自北京博奥森生物技术有限公司；石蜡切片机，德国徕卡HZ1220；激光共聚焦显微镜，德国徕卡TCS SP8 STED。

1.3 方法

1.3.1 制备PTSD模型大鼠。模型组给予单一连续应激(SPS)，建立PTSD大鼠模型。SPS应激括禁锢2分钟，强迫游泳20分钟，乙醚麻醉至昏迷。实验结束后，静养7天，自由饮水摄食。

1.3.2 灌注。①用3%戊巴比妥钠1mg/kg腹腔注射,将小鼠麻醉；②切开胸骨下端,暴露出心脏,将针尖插入心尖部,最好能插入主动脉中,但要注意避免损伤心脏,将生理盐水开关打开,冲洗全身洗液,随即再用剪刀剪开右心耳,至冲洗的颜色无血色为止,注意右心耳不能剪的太大；③关掉生理盐水开关,用4%的多聚甲醛灌注,至小鼠的肝脏发白,身体变僵硬为止；④将动物断头留取完整脑组织；⑤将脑组织立刻置于 4%多聚甲醛固定24小时。

1.3.3 制作石蜡切片。①取出组织块，进行编号，置入有孔容器；②流水冲水2小时；③脱水：50%酒精4小时→70%酒精4小时→80%酒精10小时→90%酒精3小时→95%酒精Ⅰ2小时→95%酒精Ⅱ2小时→100%酒精Ⅰ1.5小时→100%酒精Ⅱ1.5小时；④透明：1/2二甲苯+1/2无水乙醇(1h)→纯二甲苯(30分钟)；⑤浸蜡：组织经透明后放入熔化的软蜡(熔点<54℃)内2小时；然后入硬蜡(熔点>54℃)2小时；⑥包埋：将熔化的石蜡倒入包埋框再将组织块放入，放入时不能有气泡；⑦切片：选择一些完整的组织片，切片， 片厚5μm。

1.3.4 脱蜡至水。①拷片：1～1.5小时；②脱蜡：二甲苯Ⅰ 20分钟→二甲苯Ⅱ 20分钟→100%酒精Ⅰ10分钟→100%酒精Ⅱ10分钟→95%酒精Ⅰ5分钟→95%酒精Ⅱ5分钟→90%酒精5分钟→80%酒精5分钟→70%酒精5分钟；③置于摇床上，PBS缓冲液荡洗3次，每次5分钟。

1.3.5 抗原修复(微波辐射法)。①3%H2O2甲醇处理10分钟；②自来水、蒸馏水各洗一遍(勿直接冲洗)；③柠檬酸盐缓冲液浸泡，随后置于微波炉中微波辐射10分钟(前8分钟中高火加热，后2分钟高火加热)；④待修复液降至室温；⑤置于摇床上，用PBS缓冲液，荡洗三次 每次5分钟。

1.3.6 破膜处理上一抗、二抗。⑴将组织周围液体拭去，用免疫组化笔在距离组织周围1～2cm处画圈，以防滴加的各种液体外溢。将载玻片置于暗盒上操作，使其完整平稳，注意周围环境要保持湿润；⑵切片上滴加0.4%PBS-Triton，室温孵育15分钟，甩去，将多余液体吸出；⑶滴加PBS缓冲液洗涤，甩去；⑷用正常山羊血清封闭(使用PBS缓冲液1：10倍稀释)，室温孵育10分钟，甩去血清，勿洗(注意：血清同二抗种属一样)；⑸滴加一抗50μL，用PBS缓冲液以1:100稀释，4℃过夜；⑹4℃过夜后，室温自然复温45分钟；⑺PBS缓冲液，荡洗三次 每次5分钟；⑻滴加二抗(全程避光处理)：滴加Alexa Fluor488 标记羊抗兔荧光二抗与Alexa Fluor647标记羊抗小鼠荧光二抗混合液(均为1:200配置)20℃～25℃室温避光孵育2小时；⑼PBS缓冲液，洗三次 每次10分钟；⑽用含DAPI的抗荧光衰减封片剂封固，激光共聚焦显微镜镜检。⑾高倍镜下随机选取10个视野，进行阳性细胞计数，并利用分析软件分析荧光积分光密度值。

2 结果

2.1 阳性细胞数量比较 GFAP阳性细胞呈绿色荧光，Bax阳性细胞呈红色荧光。模型组GFAP阳性和Bax阳性细胞数均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。两种阳性细胞计数结果见表1、图1。

表1 两组大鼠海马胶质细胞Bax、GFAP阳性细胞计数结果比较

2.2 胶质细胞积分光密度分析 对荧光免疫组织化学染色结果分别进行光密度分析，模型组GFAP和Bax荧光积分光密度均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 两组大鼠海马胶质细胞积分光密度分析结果比较±s)

2.3 GFAP和Bax在星形胶质细胞的共存 GFAP和Bax两种蛋白荧光Merge之后呈现黄色，见图1中D和H。镜下观察，模型组黄色荧光的积分光密度高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

(A-D：对照组，E-H：模型组。AE：GFAP，BF：Bax：CG：核；DH：Merge)

3 讨论

经历自然灾害、惨重车祸、恐怖暴力等严重创伤事件的人中，罹患PTSD的比例约为25%～30%，其发病机制涉及到多个领域[9]。对PTSD的理论探讨和实证研究，越来越为学界所重视。PTSD患者总是处于创伤经历重现和极力摆脱与创伤有关回忆的冲突中,这种强烈的精神创伤导致其损害症状主要集中在中枢神经系统可塑性的领域。海马组织是在学习和记忆功能以及调节神经内分泌和自主神经活动中起重要作用的脑区[3,4]，是参与调解情感、认知、行为的重要边缘系统结构，使不断出现创伤性再体验的恐惧反应难于抑制或过分抑制。

研究表明，PTSD大鼠海马椎体神经元的树突减少，体积缩小[10]。强烈的应激反应引起的Ga2+大量内流，导致神经元细胞受损而凋亡，凋亡细胞产生的某种信号引起周围细胞内部的溶酶体释放出大量的酸性磷酸酶并用于摄取和消化凋亡的细胞，从而神经元数目减少，海马萎缩，最终引起海马体积减小。前期研究发现PTSD大鼠海马神经元凋亡增加[11]。胶质细胞是神经系统的重要组成部分，其数量是神经细胞的10～50倍，其中主要成分为星形胶质细胞。星形胶质细胞不单纯是“胶质基质”，而是具有多种复杂功能的中枢神经系统的主动参与者。但在PTSD发病过程中，关于星形胶质细胞的功能改变，目前少有报道。GFAP是星形胶质细胞的特异性标记蛋白，采用荧光标记方法可以原位显示星形胶质细胞[12]。Bax蛋白是一种促凋亡蛋白，其表达升高提示细胞凋亡增强。本研究采用激光共聚焦方法观察GFAP和Bax的表达，以此检测PTSD大鼠海马星形胶质细胞的凋亡情况。结果表明，PTSD大鼠海马星形胶质细胞GFAP和Bax阳性细胞数量以及二者荧光积分光密度均高于对照组，提示PTSD大鼠海马星形胶质细胞中Bax表达明显增强，星形胶质细胞的凋亡可能与PTSD发病机制密切相关。

注：实验中TUNEL染色实验失败，由于作者面临实习工作考研，无法继续实验，所以只做了Bax指标。

[1] 刘玉莹.PTSD症状个体情绪性记忆定向遗忘的实验研究[D].成都：四川师范大学,2012

[2] 朱 承.创伤后应激障碍患者海马体积及代谢物水平的在体研究[D].汕头：汕头大学,2008

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[5] 王 磊.星形胶质细胞在神经系统疾病中的作用[J].生物技术通报，2010，26(6):34-36

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[7] 李卉丽,秦绿叶,万 有,等. 疼痛研究的新亮点:星形胶质细胞[J].生理科学进展,2003,34(1):45-48

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[9] 段 妮,冯玉芳,刘彩兴.创伤后应激障碍研究进展[J].四川精神卫生,2014,27(6):575-576

[10] 袁 辉.PTSD样大鼠海马神经元凋亡及LTP,ACP变化的研究[D].沈阳：中国医科大学,2008

[11] 王海涛,刘 昊,徐爱军,等.创伤后应激障碍大鼠海马和杏仁核中神经元凋亡及Caspase-9的表达及其意义[J].吉林大学学报(医学版),2013,39(3):427-431

[12] 杨春蕊.小鼠抑郁症模型建立及干预、行为学和海马GFAP变化研究[D].昆明：昆明医科大学,2013

(2016-05-04 收稿)(张爱国 编辑)

Bax expression in the hippocampus astrocytes of PTSD model rats

YANShuai,GAOSonglin,CHENYujie,etal

(ClinicalMedicalSchool,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To observe the expression of Bax in hippocampus astrocytes of post-traumatic stress disorder (PTSD) model rats.Methods Male wistar rats were divided into model group and control group randomly.Single-prolonged stress was used to built PTSD rats model,and laser scanning confocal microscopy was used to observe the coexistence of GFAP and Bax in hippocampal astrocytes.Results The number of positive cells and integral optical density of GFAP,Bax in hippocampal astrocytes in the hippocampus of model group were higher than that in control group rats significantly(P<0.05).Conclusion The Bax expression of hippocampal astrocytes in PTSD model rats is increase, which may be involved in the pathogenesis of PTSD.

Post-traumatic stress disorder.Hippocampus.Astrocyte.Laser scanning confocal microscopy

华北理工大学大学生创新创业训练计划项目(编号：X2015152)。

闫帅(1992-)，女，本科生。研究方向：医学影像。

王海涛。

R 749.99

A

2095-2694(2016)06-421-04