硼酸抗白念珠菌作用的试验研究

高吉 潘丽娜 郭东东 魏羽佳

(贵州医科大学附属医院皮肤科，贵阳 550004)



·论著·

硼酸抗白念珠菌作用的试验研究

高吉 潘丽娜 郭东东 魏羽佳

(贵州医科大学附属医院皮肤科，贵阳 550004)

目的 探讨硼酸对白念珠菌临床分离株菌株的生长状态和细胞形态的影响。方法 用加入0%、0.1%、0.15%硼酸 (w/v)的Lee’s glucose培养基于25℃和37℃分别培养8株临床分离的白念珠菌，观察各菌株在不同培养条件下生长状况。结果 25℃培养条件下，0.1%的硼酸明显抑制白念珠菌生长，其中对HJ065的抑制效果最明显，0.15%的硼酸进一步抑制白念珠菌生长，并且SC5314、HJ058菌株的菌丝生长能力随硼酸浓度增高而减弱。37℃培养条件下，硼酸对白念珠菌生长状态和菌丝生长能力的抑制效果较25℃更明显。相同培养条件下，硼酸对不同CAI重复数的白念珠菌的抑制效应存在差异。结论 硼酸对白念珠菌临床分离菌株的抑制作用表现出明显菌株的差异性。其抑制作用与培养温度有关：表现为生理温度下抑制作用更明显。硼酸对8株白念珠菌抑制作用与CAI的重复数无明显相关性。

白念珠菌；硼酸；耐受性；CAI

[Chin J Mycol，2016，11(5):275-278]

近几十年来随着广谱抗生素和免疫抑制剂在临床上的广泛使用、艾滋病的流行及人口老龄化等原因，导致免疫功能缺陷患者增多，真菌感染的发病率呈明显上升的趋势。尤其是侵袭性念珠菌感染严重威胁人类健康，其死亡率达40%以上[1-2]。白念珠菌通常共生于人体不引起疾病，当人体免疫功能受损时，该菌容易过度生长并危害人体健康。研究表明，白念珠菌形态发生与其致病性密切相关[3]，比如酵母-菌丝形态之间的转换与白念珠菌侵染宿主上皮细胞屏障和逃避免疫细胞的吞噬作用有密切关系[4-7]。

常用抗真菌药物的长期使用导致白念珠菌耐药菌株的出现，给临床上念珠菌病的治疗带来很大困难。因此，开发新型抗念珠菌药物或开拓新治疗策略，具有重要的现实意义。硼酸是一种多功能分子，高浓度的硼酸混合物可用于防腐、消毒或杀虫。低浓度时，有益于各种生化及生理过程，如植物细胞壁的稳定及生物骨盐沉积[8]。硼酸在临床上用于皮肤、口腔、黏膜、膀胱等伤口的冲洗，加速伤口愈合[9]。研究表明，硼酸可用于治疗阴道耐药念珠菌感染[10]，并可部分抑制白念珠菌酵母形态向菌丝形态转换[11]。微卫星序列广泛存在于真核生物基因中，是一类优良的遗传标记。白念珠菌中三核苷酸单元 (CAA/G)重复数决定其微卫星序列CAI的多态性，因CAI位点易识别性和物种特异性的优点而被广泛用于白念珠菌的流行病学的研究[12-13]。研究表明白念珠菌CAI基因型与其在不同宿主组织中的定植能力和耐药性具有明显相关性，CAI基因型与白念珠菌形态转换也有较大关系，特别是白念珠菌的white-opaque形态转换[14]。

既然硼酸可用于治疗念珠菌感染，而CAI基因型与白念珠菌的耐药性相关，为弄清硼酸对不同组织来源的白念珠菌的影响，我们选取分离于人体不同部位的7株白念珠菌临床分离株和1株实验室标准菌株进行研究，比较硼酸对不同白念珠菌的抑制作用，并分析抑制作用与CAI重复数之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株 实验室标准菌株SC5314，7株白念珠菌临床分离株 (分离自北大医院男性生殖器、口腔黏膜、唾液等人体不同部位)：HJ058、HJ059、HJ071、HJ065、HJ074、HJ029、HJ055。

培养基 Lee’s glucose培养基根据参考文献[15]，pH调至6.8，加入2%琼脂 (Becton，Dicknson and Company，美国)，110℃，15 min高压灭菌，待温度降至50～60℃左右时，加入荧光桃红B (phloxine B，5 μg/mL，Sigma，美国)和4%硼酸溶液 (w/v)至硼酸终浓度分别为0%、0.1%、0.15%，混合均匀后倒板。

实验器材与装置 电热恒温培养箱 (上海一恒科学仪器有限公司)，生物显微镜 (B203LED,重庆奥特光学仪器有限公司)，血细胞计数板 (0.10 mm，1/400 mm2)，体式显微镜 (M125，莱卡)，正置荧光显微镜 (Axio Imager A2，德国zeiss)。

1.2 方法

梯度稀释培养法：活化8株白念株菌临床分离株，放30℃温箱培养2 d。取适量单菌落于1 mL双蒸水中，混匀后用血细胞计数板在生物显微镜下计数，根据计数量推算出原液浓度，将原菌液稀释为5×107CFU/mL，逐一10倍梯度稀释，至菌液浓度为5×103CFU/mL，制备上述5种浓度菌液待用，每株菌5个浓度分别取2 μL点到含0%、0.1%、0.15%硼酸的Lee’s glucose平板上，后分别放置25℃培养5 d，37℃培养3 d，并观察菌体生长情况及对硼酸耐受性，并用体式显微镜观察各株菌细胞形态并拍照。

涂板：将8株临床白念珠菌原菌液稀释到1×103CFU/mL，分别取100 μL于含0%、0.1%、0.15%硼酸的Lee’s glucose平板上，均匀涂板，使每板上有100个细胞左右，后分别放置25℃培养5 d或37℃培养3 d。观察各分离株菌落形态。

2 结 果

2.1 白念珠菌临床分离株相关信息

Hu等[14]根据微卫星CAI基因型CAG序列的重复数将白念珠菌分为六类，我们选取具有代表性的CAI-1、CAI-4和CAI-6三类中的8株菌株，其中包括实验室常用菌株SC5314。8株菌株的MTL及CAI基因型如表1所示，其中HJ055、HJ074、HJ058、HJ071属于CAI-1类，这四株菌的CAI重复数较少，HJ065和HJ059属于CAI-4类，这两株菌的CAI重复数中等，HJ029、SC5314属于CAI-6类，CAI重复数较高。

2.2 25℃条件下，硼酸对不同临床菌株的影响

首先我们在25℃条件下Lee’s Glucose培养基中观察硼酸对白念珠菌的不同临床菌株生长状况的影响。如图1所示，硼酸浓度为0.1%时，8株菌的生长相比0%硼酸时都受到很大的抑制。从梯度稀释培养法形成的菌落形态上看，这几株菌相互之间的生长趋势没有太大差异，但单克隆的生长状况不一致，HJ058、HJ059、HJ071、HJ029单克隆与SC5314单克隆大小基本相同，而HJ065、HJ074和HJ055的单克隆生长较SC5314慢,单克隆大小较SC5314小。硼酸浓度为0.15%时，打点的克隆中只有菌体浓度高 (细胞数105cells，即第1打点处)时才能存活，但长势较弱，而菌体浓度较低时基本不生长，而HJ065的菌体浓度较高时也不生长。所有菌株的单克隆在0.15%硼酸浓度时，25℃培养5 d仍见不到克隆长出。8株菌的细胞形态在不同的硼酸浓度时也有差异，在不含硼酸的培养基上，细胞形态较小，且SC5314有些细胞长出菌丝形态，随着硼酸浓度的增加，菌丝生长能力减弱，细胞状况也较差，其余菌株出现细胞膨大、空泡。

表1 白念珠菌临床分离菌株CAI重复数、MTL基因型及所属CAI类别

Tab.1 The CAI types,MTL genotypes and the CAI categories ofCandidaalbicans

菌株CAIMTLCAI类型HJ05511/18a/alphaCAI-1HJ07411/18a/alphaCAI-1HJ05817/17a/alphaCAI-1HJ07118/18a/alphaCAI-1HJ06520/20a/alphaCAI-4HJ05923/23a/alphaCAI-4HJ02944/44a/alphaCAI-6SC531438/44a/alphaCAI-6

2.3 生理温度 (37℃)下，硼酸对不同临床菌株的影响

人体分离的白念珠菌的生长温度为37℃。我们在37℃培养3 d观察这8株白念珠菌的生长状况，如图2所示，生理温度下硼酸对白念珠菌的抑制效果更明显。在0.1%硼酸浓度时培养条件下只有HJ071、HJ058和HJ029的耐受性与SC5314较一致，打点处细胞数为102个细胞 (即第4个点的细胞数)时仍可见克隆长出，这几株菌的单克隆生长速率明显低于SC5314，单克隆较SC5314小。HJ055、HJ074、HJ065、HJ059的长势较SC5314弱很多，打点菌落在菌体数最高105个细胞时 (即第1个点的细胞数)也基本长不起来，单克隆培养3d时隐约可见。当硼酸浓度提高到0.15%时，只有HJ071可长出较小的单克隆，其他菌株都基本不能生长，尤其是HJ059、HJ065完全不生长，拍摄细胞图所用细胞来源于打点的高浓度菌体菌斑处，可见细胞膨大，有些细胞出现空泡状，基本处于死亡状态。高浓度硼酸对HJ058、SC5314菌丝生长也有明显抑制作用。

图1 25℃条件下8株白念珠菌临床分离株在不同硼酸浓度培养基中的菌落形态和细胞形态 (硼酸浓度为0.15%时，细胞图所用菌体来源于打点处的高浓度菌斑) 图2 生理温度 (37℃)条件下8株白念珠菌临床分离菌株在不同硼酸浓度培养基中的菌落形态和细胞形态 (白框处无菌)

Fig.1 Colony and cellular morphologies of eight clinical isolates ofC.albicansunder different concentration of boric acid at 25℃ Fig.2 Colony and cellular morphologies of eight clinical isolates ofC.albicansunder different concentration of boric acid at 37℃

2.4 白念珠菌对硼酸的耐受性与CAI类型的相关性分析

硼酸对不同CAI类别的8株临床菌株的抑制作用如表2所示，25℃时CAI-6类的SC5314与CAI-1类的HJ058生长趋势基本相似，表比其他菌株的生长状况较好，CAI-1类的HJ055、HJ074两株菌与CAI-4类的HJ065菌株的生长状况基本一致，较SC5314长势差。CAI-1的HJ071与CAI-4的HJ059无明显差异。硼酸对同属CAI-1类的HJ058、HJ055、HJ074、HJ071的作用效果不同，而对不同CAI类型之间的影响有相似、也有不同。37℃时，硼酸对白念珠菌抑制作用更强，CAI-1的HJ071受硼酸的影响相对较其他菌株较小，CAI-1类的HJ074与CAI-6的HJ029其次，其余菌株受硼酸的抑制作用显著。硼酸对白念珠菌的抑制程度与CAI类型无明显相关性，CAI-1类的HJ055、HJ058，CAI-4类的HJ065、HJ059，及CAI-6类的SC5314均受到硼酸的明显抑制。由此可以看出,25℃或37℃条件下，硼酸对8株不同来源的白念珠菌株均有较强的抑制作用，并且临床菌株受硼酸的影响与其CAI的重复数没有太大关系。

表2 白念珠菌临床分离菌株CAI类型、所属CAI类别及受硼酸抑制程度

Tab.2 The CAI types,CAI categories ofCandidaalbicansclinical isolates and boric acid tolerance

菌株CAICAI类型抑制程度(+++,0.15%硼酸)25℃37℃HJ05511/18CAI-1+++++++HJ07411/18CAI-1++++++HJ05817/17CAI-1+-+++++HJ07118/18CAI-1++++HJ06520/20CAI-4++++++++HJ05923/23CAI-4+++++++HJ02944/44CAI-6++++SC531438/44CAI-6++++++

3 讨 论

硼酸在对于治疗阴道酵母菌感染有长期疗效，它能破坏白念珠菌菌丝的细胞骨架从而抑制白念珠菌的侵袭性生长。本研究中，我们在Lee’s glucose中添加不同浓度硼酸作为培养基，在25℃和37℃条件下培养，通过观察实验室白念珠菌标准菌株SC5314在不同硼酸浓度下的生长状况。发现0.1%～0.15%的硼酸浓度能够较好的抑制白念珠菌的生长，与先前报道临床上0.1%的硼酸对白念珠菌有较好的治疗效果相符合[15]，此浓度能有效控制白念珠菌的菌丝相形成，防止对人体造成危害，同时又保证不完全杀灭白念珠菌。我们选择0.1%和0.15%的硼酸浓度作为培养条件观察8株白念珠菌临床菌株受硼酸的影响。

8株临床菌株在相同培养条件下抗硼酸的能力有菌株差异性，尤其是各菌株单克隆生长状况差异性较为明显，如在25℃，0.15%硼酸培养条件下，HJ065较其余菌受硼酸抑制作用更明显。37℃，0.15%硼酸中HJ071较其余菌受抑制作用更弱。细胞形态方面，相同温度、培养时间及浓度硼酸中，各细胞大小、生长速度快慢有差异，随硼酸浓度增加SC5314、HJ058菌丝有受抑制趋向，相对于酵母形态，菌丝形态细胞对宿主有着更强的侵袭性，由实验可以看出硼酸对白念珠菌菌丝生长有一定的抑制作用。由于菌株取材于人体不同部分，可以推断人体不同部位感染的白念珠菌对硼酸的敏感程度不一致。另外，由表2可以看出，8株菌株对硼酸的敏感性与温度相关，相同硼酸浓度时，各菌株在生理温度37℃培养条件下较25℃时受硼酸抑制程度更显著，以HJ058在两温度间差异性最大，为硼酸可用于临床治疗连珠菌感染提供理论依据。有研究表示其中CAI类型与白念珠菌形态转换有较大关系，其形态转换与其致病性有关，特别是白念珠菌的white-opaque形态转换。临床分离的白念珠菌主要以MTLa/alpha的基因型的white形态存在，常规培养条件下white很难向opaque形态的转换。研究表明CAI的重复数越多，白念珠菌越容易向opaque形态转换。白念珠菌的形态转换与其在不同宿主组织中的定植能力和耐药性密切相关。本文中关于硼酸对不同CAI分型的白念珠菌的作用研究发现,硼酸对分属于CAI-1、CAI-4、CAI-6类别的8株白念珠菌菌株的抑制作用均有差异，表明白念珠菌受硼酸抑制作用程度与CAI的重复数无相关性，如CAI-1类的HJ071在0.15%的硼酸浓度下仍可长出单克隆，而同为CAI-1类的HJ074在0.1%的硼酸浓度下长势也很弱。

临床中硼酸在伤口冲洗、皮炎湿疹治疗等方面应用较多，本研究发现白念珠菌的生长状况和菌丝生长能力均受到硼酸的明显抑制，使用硼酸治疗念珠菌感染有利于减少抗真菌药物的使用，同时减少新兴多药物耐药菌株的威胁[16],具有安全、经济、副作用少等优点，为临床治疗白念珠菌感染带来了新方向。硼酸是通过什么分子机制和途径抑制白念珠菌菌丝生长等问题有待进一步深入研究。

致谢感谢中国科学院微生物研究所黄广华研究员和曹承俊在文章写作中提供的帮助。

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Experimental study on the effect of boric acid againstCandidaalbicans

GAO Ji,PAN Li-na,GUO Dong-dong,WEI Yu-Jia

(DepartmentofDermatology,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004)

Objective We aimed to study the different effects of boric acid on cell growth and cell morphology in eight clinical isolates ofCandidaalbicans.Method Lee's glucose media containing different concentration of boric acid (0%,0.1%,0.15%) were used for cell growth ofCandidaalbicans.The growth of the strains in different culture conditions were observed.Result When treated with 0.1% of boric acid at 25℃,the growth of eight strains were extremely inhibited,especially HJ065.When treated with 0.15% of boric acid,the growth of all strains were further inhibited.Boric acid with high concentration impacted the filamentation growth of HJ058 and SC5314.At 37℃,the inhibition effect of boric acid on the growth ofC.albicnaswas more obvious than at 25℃.Under the same culture condition,the effect of boric acid had no relationship with the number of CAI inC.albicans.Conclusion The inhibitory effect of boric acid on the clinical isolates ofCandidaalbicansshowed significant differences among the strains,and also was related to the culture temperature.Under physiological temperature,C.albicanswas more sensitivity to boric acid.There was no significant correlation between the inhibitory effect of boric acid and the CAI genotype of the 8 strains ofC.albicanswe used.

Candidaalbicans;boric acid;tolerance;CAI

贵州省优秀科技教育人才省长专项资金 (【2011】28号)

高吉，女 (仡佬族)，硕士研究生在读.E-mail:176358070@qq.com

魏羽佳,E-mail:362971672@qq.com

R 379.4

A

1673-3827(2016)11-0275-04

2016-04-20 [本文编辑] 施 慧