MALDI-TOF-MS技术在酵母样真菌鉴定中的临床应用评价

张霄霄 汪定成 戈伟 邵海莲 程芝 苏博 台锦阁 杨铭 张倩 陈静文 张惠中

(第四军医大学唐都医院检验科，西安 710038)



·论著·

MALDI-TOF-MS技术在酵母样真菌鉴定中的临床应用评价

张霄霄 汪定成 戈伟 邵海莲 程芝 苏博 台锦阁 杨铭 张倩 陈静文 张惠中

(第四军医大学唐都医院检验科，西安 710038)

目的 评价基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight- Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)技术对酵母样真菌鉴定的临床应用价值。方法 将2015年6月～2016年6月临床检出的142株酵母样真菌标本同时采用MALDI-TOF-MS技术和传统真菌培养方法进行鉴定，记录结果并对结果进行对比分析。结果 两种方法对于常见的白念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌和新生隐球菌的鉴定率很高 (100%)，符合率较高 (100%)；对于少见的葡萄牙念珠菌、解脂念珠菌、产朊念珠菌，两种方法的符合率较低，分别为25.00%、00.00%、00.00%。结论 MALDI-TOF-MS技术对酵母样真菌的鉴定率较高，操作简便快速，是传统真菌培养鉴定的有力补充，可将其推广应用于酵母样真菌的早期快速鉴定。

基质辅助激光解析电离飞行时间；酵母样真菌；鉴定

[Chin J Mycol，2016，11(5):285-288]

由于激素、广谱抗生素和抗肿瘤药物等在临床上的广泛应用，免疫功能低下人群的不断增加，酵母样真菌感染的患者逐年递增[1]。临床实验室常规传统真菌培养鉴定方法周期长、操作繁琐，生化鉴定及菌落形态也需要有经验的工作人员才能完成。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MAL-DI-TOF-MS)技术是目前微生物鉴定领域的新技术，准确快速是其最大的特点[2]。质谱技术 (Mass Spectrometry，MS)就是将待检样品通过诱导碰撞转化为运动的气态离子碎片，并按质荷比 (m/z)大小顺序排列的图谱[3]。2012年Firacative等[4]利用质谱技术对164株新生隐球菌和格特隐球菌进行鉴定，可以100.00%鉴定到种，并且可以对8个主要分子类型 (新生隐球菌 VNⅠ-VN Ⅳ、格特隐球菌VGⅠ-VG Ⅳ)进行分类。Sendid等[5]对1 207例临床酵母菌分别采用MALDI-TOF-MS和传统的科玛嘉酵母菌显色培养基，联用API ID 32C生化鉴定试剂盒的方法鉴定，发现两者符合率可达91.5%，通过ITS区测序，在不符合结果的74株标本中，73株显示MALDI-TOF-MS方法鉴定正确。上述实例可说明MALDI-TOF-MS技术检测酵母菌的准确率高，结果可靠，适用于临床快速鉴定。因此，本实验针对临床分离的酵母样真菌菌株，分别采用MALDI-TOF-MS技术和传统真菌培养方法进行鉴定，评估结果，并进行统计分析。

1 材料与方法

1.1 参考菌株来源

校准菌株：大肠埃希菌ATCC8739。质控菌株：白念珠菌ATCC90028，近平滑念珠菌ATCC22019。质控菌株购自卫生部临床检验中心。

1.2 仪器与试剂

VITEK MALDI-TOP MS质谱仪及配套试剂、哥伦比亚血平板均购自法国梅里埃公司；SPX-150BIII型生化培养箱 (天津泰斯特仪器有限公司)；BD BECTEC 9120血培养仪 (美国BD公司)；沙堡弱培养基 (英国OXOID公司)；显色培养基 (法国科玛嘉公司)；革兰染液 (珠海贝索生物技术有限公司)；日本奥林巴斯显微镜 (OLYMPUS CX21)；酵母样真菌同化试验编码鉴定管TH-15C (杭州滨和微生物试剂有限公司)。

1.3 酵母样真菌的分离及培养

痰液、皮肤拭子、粪便、分泌物等标本直接分别接种至哥伦比亚血平板和沙堡弱培养基。尿液3 000 r/min离心15 min后接种至哥伦比亚血平板和沙堡弱培养基。静脉血、脑脊液、胸腹水等先接种至需氧培养瓶，35℃血培养仪中进行检测，有阳性瓶报警后分别接种至哥伦比亚血平板和沙堡弱培养基。所有哥伦比亚血平板和沙堡弱培养基放置到35℃培养箱中孵育，待培养出肉眼可见的菌落，镜检见到真菌孢子后，挑取单个菌落分纯后再分别进行MALDI-TOF-MS和传统真菌培养方法鉴定，记录所鉴定出真菌的种类。

1.4 MALDI-TOF-MS方法鉴定

根据VITEK MALDI-TOF MS标准操作流程，用1 μL定量接种环直接挑取新 鲜纯菌落涂在靶板点位内，先加0.5 μL VITEK MALDI-TOF MS FA试剂待干燥，再将标准菌株ATCC 8739涂在靶板的校准点位中，所有检测位点加入1 μL Vitek MS-α-氰基-4-羟基肉桂酸基质液，待干燥后放入MALDI-TOF MS仪器获取细菌全细胞蛋白质谱，然后将待测菌质谱和数据库已知菌质谱进行比较分析从而获得鉴定结果。VITEK MALDI-TOF MS结果分为3种颜色：绿色表示唯一的鉴定结果，可信概率 (60.0%～99.9% )；黄色表示低分辨率结果，可信概率 (>60.0%)需要进一步做补充试验才能确定；红色表示不能鉴定，可信概率 (<60.0%)与数据库的任何质谱不匹配[6]。

1.5 传统真菌培养方法鉴定

将培养出的纯菌直接接种于显色培养基上，35℃，培养24～48 h，观察其菌落颜色，依据菌落显示的颜色进行菌种鉴定；将纯培养物转种葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇等糖同化管，35℃，孵育24～48 h，观察糖同化管浊度变化[7]，根据已知酵母菌的生化特性达到鉴定目的。

2 结 果

2.1 MALDI-TOF-MS鉴定结果

使用质谱仪共检测2015年6月～2016年6月经医院临床分离出的142株酵母样真菌菌株。根据不同菌种各有其特征的质谱峰，结果在可信概率之间的酵母样真菌有135株，占95.07%，未鉴定出的真菌占4.93%。其中43株鉴定为白念珠菌，25株热带念珠菌，16株光滑念珠菌，11株近平滑念珠菌，10株葡萄牙念珠菌，10株克柔念珠菌，6株菌膜念珠菌，6株解脂念珠菌，4株产朊念珠菌，4株新生隐球菌，0株异常汉逊酵母菌。

2.2 传统真菌培养方法鉴定结果

用传统真菌培养方法鉴定出的酵母样真菌有113株，占79.58%，未鉴定出的真菌占20.42%。其中43株为白念珠菌，25株热带念珠菌，9株光滑念珠菌，11株近平滑念珠菌，2株葡萄牙念珠菌，10株克柔念珠菌，6株菌膜念珠菌，0株解脂念珠菌，0株产朊念珠菌，4株新生隐球菌，3株异常汉逊酵母菌。

2.3 MALDI-TOF-MS技术与传统真菌培养方法鉴定结果比较

两种方法对于白念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、菌膜念珠菌、新生隐球菌的鉴定率很高 (100%)，且符合率较高；对于近平滑念珠菌的检测，两种方法鉴定率都为78.57%；对于葡萄牙念珠菌、解脂念珠菌、产朊念珠菌、异常汉逊酵母菌的检测，符合率较低，分别为20.00%、00.00%、00.00%、00.00%。见表1。

3 讨 论

近年来临床上由于酵母样真菌所造成的重度感染逐渐增多，尤其是免疫低下人群发病率呈逐年上升的趋势。因此，早期快速准确的鉴定出酵母样真菌已经成为临床诊断和治疗的关键[8]。

本实验通过MALDI-TOF-MS技术与传统真菌培养鉴定方法对临床分离的142株酵母样真菌标本鉴定结果进行比较，结果显示：两种方法对于常见的白念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、新生隐球菌的鉴定率很高，符合率较高；对于少见的葡萄牙念珠菌、解脂念珠菌、产朊念珠菌、异常汉逊酵母菌的检测，符合率较低，分别为20.00%、00.00%、00.00%、00.00%。从总体来看，MALDI-TOF-MS技术对酵母样真菌的鉴定率高于传统真菌培养方法的鉴定率。

表1 两种方法对酵母样真菌的鉴定率与符合率 (%)比较

在临床工作中,传统真菌培养方法中的分离培养是微生物实验室必不可少的基本技术，是获得纯培养物的必要手段。然而对人类致病的细菌及酵母样真菌，在利用传统培养、手工生化法鉴定时需要技术人员有较多的工作经验，且易受到多因素影响[9]。培养鉴定过程耗时长，且最后可能得不到正确的鉴定结果，尤其是对于一些不常见菌株更不容易鉴定出来[10]。本次实验中利用传统真菌培养鉴定方法有29例酵母样真菌未检出，经分析原因可能是：(1)传统真菌培养方法依赖致病菌的生长代谢，且真菌细胞壁硬度大，生化反应不明显，导致对其鉴定错误或者鉴定不出。(2)某些酵母菌生化反应相似，难于区分。(3)培养基质量、培养温度、培养时间等都会影响传统真菌培养检测方法的准确。MALDI-TOF-MS技术在酵母菌属鉴定方面应用比较广泛，且极大的缩短了临床鉴定时间，使临床患者的治疗成功机会显著增加[11]。质谱数据库已经包括了大量临床酵母菌的参考图谱，尤其适用于不常见的酵母菌。从这些方面看，质谱技术有一定的优势。但是利用质谱仪对酵母样真菌的检测仍然存在着一些问题。本实验中采用MALDI-TOF-MS技术有7例酵母样真菌未检出，经分析原因可能是：(1)真菌菌落一般较干燥、细胞壁厚，未能与甲酸更好的结合破壁，核蛋白未完全释放出来。(2)数据库不完善，图谱库中未含有此菌，还需不断补充。(3)靶点涂菌不均匀，过薄或过厚均不能形成较好的结晶[12]。(4)临床上有些菌株缺乏特异性峰值或峰值数量不足，无法形成图谱而不能鉴定[13]。

综上所述，MALDI-TOF-MS是一种快速、准确、通量高、成本相对较低的新型真菌检测方法。采用质谱技术检测可降低传统真菌培养方法对罕见酵母样真菌的漏诊率，且该技术操作简易，只需要简单的培训就可以上机进行菌种的鉴定。然而传统真菌培养方法特别是涂片加分离培养依然很重要，MALDI-TOF-MS是传统真菌培养鉴定方法的有力补充，为真菌的鉴定提供了新的选择，建议在条件允许的情况下可以同时使用两种检测方法。

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[本文编辑] 施 慧

Evaluation of the clinical application of MALDI-TOF-MS technology in detection of yeast-like fungi

ZHANG Xiao-xiao，WANG Ding-cheng，GE Wei，SHAO Hai-lian，CHENG Zhi，SU Bo，TAI Jin-ge，YANG Ming，ZHANG Qian，CHEN Jing-wen,ZHANG Hui-zhong

(TangDuHospital，Xi'an710038，China)

Objective MALDI-TOF-MS technology was evaluated the clinical application value of MALDI-TOF-MS in the rapid identification of yeast-like fungi.Methods MALDI-TOF-MS technology and traditional fungi cultural method were used to identify 142 yeast-like fungi of clinical isolates which from June 2015 to June 2016,results were recorded and analyzed.Results The rate of identification of two methods for commonC.albicans,C.tropical,C.kruseiandCryptococcusneoformanswere very high (100%),concordant rate was 100%;The rate of identification of two methods for uncommonC.lusitaniae,C.lipolyticaandC.utiliswere very low,concordant rate were 25.00%,00.00% and 00.00% respectively.Conclusion MALDI-TOF-MS had a better identification rate of yeast-like fungi,and the characteristic of simple and rapid operation provided a powerful complement for traditional manual method,which could be applied in the early rapid identification of yeast-like fungi.

MALDI-TOF-MS;yeast-like fungi;detection

张霄霄，女 (汉族)，检验技师.E-mail:644136010@qq.com

张惠中,E-mail:huizz328@163.com

R 446.5

A

1673-3827(2016)11-0285-04

2016-08-05