CD147参与大鼠神经病理性疼痛发生与发展中的作用*

任应娜,苏利伟,杨海龙

陕西省宝鸡市中心医院 麻醉手术科(宝鸡 721008)



·论 著·

CD147参与大鼠神经病理性疼痛发生与发展中的作用*

任应娜,苏利伟,杨海龙

陕西省宝鸡市中心医院 麻醉手术科(宝鸡 721008)

目的 探讨CD147在大鼠神经损伤后痛觉敏化形成中的作用。方法 分别采用免疫荧光染色法和Western blotting法检测大鼠脊神经结扎(SNL)后脊髓与背根神经节CD147的表达，采用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测大鼠背根神经节内CD147 mRNA的表达。大鼠背根神经节内注射CD147过表达RNA或干涉RNA后，观察机械性缩足反应阈值(MWT)的变化。结果 正常大鼠脊髓几乎不表达CD147，且SNL后脊髓CD147表达几乎无变化；正常大鼠背根神经节有少量CD147表达，SNL后CD147和mRNA表达均升高；大鼠背根神经节内注射对照RNA或过表达RNA后，对照组大鼠MWT未见明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)，RNA过表达组大鼠的痛域降低，差异有统计学意义(P<0.05)。大鼠背根神经节内注射对照RNA或干涉RNA后，对照组MWT下降，干涉RNA组痛域亦下降，但仍高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 外周神经损伤后，大鼠背根神经节内CD147及其mRNA表达均上调；CD147过表达可诱发神经病理性疼痛，干涉CD147 RNA表达，抑制神经病理性疼痛。

CD147; 神经病理性疼痛; 脊髓; 背根神经节; 机械性缩足反应阈值

神经病理性疼痛(NP)又称为神经源性疼痛，是一种由中枢或周围神经系统疾病、结构损害或功能障碍引起的疼痛[1]。与急性疼痛不同，NP常在原发疾病或损伤痊愈后仍持续存在数月、数年，甚至终身伴随，严重影响人们生活质量[2]。近年来，随着对NP机制研究的逐步深入，黏附分子在其形成中的作用备受关注。大量研究[3-5]表明，黏附分子L1、神经细胞黏附分子、整联蛋白、选择蛋白等黏附分子在NP的产生与维持中发挥重要作用。CD147为黏附分子家族中的免疫球蛋白超家族，在免疫炎症性疾病和肿瘤转移与浸润中的研究较多，但对其是否参与神经损伤后痛敏形成的研究较为少见。本研究通过探讨CD147在大鼠神经损伤后痛觉敏化形成中的作用，旨在为NP的发生机制提供新的研究途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

健康成年雄性SD大鼠36只，体质量180～220 g， 由第四军医大学实验动物中心提供。每只动物进行单独饲养，并实行12 h明暗交替照明来维持其生物节律。

小鼠抗CD147(美国Santa Cruz公司)，小鼠抗β-actin(美国Chemicon公司)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG(北京中山金桥生物有限公司)，兔抗Collagen Ⅳ、兔抗Laminin、Alexa488标记的羊抗兔IgG和Alexa594标记的羊抗鼠IgG均购自美国Sigma公司。

1.2 分组

1)取雄性SD大鼠12只，随机分为假手术组与SNL模型组，各6只，Western blotting检测不同时间点背根神经节内CD147变化情况，同时采用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同时间点CD147 mRNA的变化。2)取雄性SD大鼠12只，随机分为背根神经节内注射对照RNA组与背根神经节内注射过表达RNA组，各6只，观察机械性缩足反应阈值(MWT)的变化。3)另取雄性SD大鼠12只，随机分为背根神经节内注射对照RNA与背根神经节内注射干涉RNA组，各6只，再制成SNL模型，监测SNL模型后大鼠机械性缩足反应阈值(MWT)的变化。

1.3 方法

1.3.1 脊神经结扎(SNL)模型制备 大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉，以双侧髂后上棘连线为中线，后正中线向左旁开0.5 cm做一纵行切口(长约1.5 cm)，分离皮下肌肉后切除腰6横突，并使下方腰5脊神经得以分离，采用5-0丝线紧紧结扎2次[6]。术后，将所有动物转运至饲养室，密切观察其恢复情况。除了从腰5脊神经下穿过而不结扎外，假手术组其他操作同手术组。

1.3.2 行为学评估 上午8：00至12：00，对机械性缩足反应阈值(MWT)进行测定，首先使大鼠在测试环境中适应3 d，1 h/次。测试当天，将其放入有机玻璃箱中适应30 min，采用von Frey纤维丝刺激大鼠后足底中部，以纤毛丝弯成“S”为准，持续时间≤5 s。若出现抬足或舔足行为，为阳性反应，否则为阴性反应；出现行走，则应重新测试[7]。

1.3.3 Western blotting检测 分别于术前(对照)及术后1、3、7、14、21和28 d取脊髓与背根神经节做蛋白半定量：麻醉后使胸腔打开，经主动脉快速灌注预冷的0.01%磷酸盐缓冲液(PBS)，低温下取腰5段脊髓新鲜标本；根据试剂盒说明书进行操作，分离电泳，封闭后采用小鼠抗CD147(1∶500)、小鼠抗β-actin(1∶5 000) 4 ℃过夜，室温下孵育二抗HRP标记的羊抗小鼠IgG(1∶5 000) 2 h；最后采用凝胶成像分析系统拍照，分析条带。

1.3.4 RT-PCR 取神经节组织，置入EP管中称量，每100 mg组织加入1 mL trizol，采用匀浆器研磨后倒入EP管中；加入1/5体积的氯仿，静置5 min后离心，12 000 r/min，取上清置于另一EP管中；加入等体积的异丙醇，静置10 min后离心，12 000 r/min，直至出现白色沉淀，即总RNA。白色沉淀溶解后，进行定量；取2 μL RNA，采用紫外分光光度计在260、280波长处检测稀释后的RNA吸光度值，并计算A260/A280比值和RNA浓度(浓度=A260×40×稀释倍数)；合成cDNA，逆转录反应和PCR扩增根据RT-PCR试剂盒说明书进行。

1.3.5 免疫荧光染色 取脊髓与背根神经节进行免疫荧光染色：麻醉后使胸腔打开，经主动脉快速灌注0.01% PBS，用4%多聚甲醛灌流固定；取腰5脊髓，在多聚甲醛固定液中固定4 h后移至20%、30%蔗糖的0.1 mol/L PB中过夜，直至沉底；冠状切片，厚30 μm，PBS漂洗后加入小鼠抗CD147(1∶500)、兔抗Collagen Ⅳ(1∶200)、兔抗Laminin(1∶400)，4 ℃孵育过夜。二抗采用Alexa488标记的羊抗兔IgG(1∶500)与Alexa594标记的羊抗鼠IgG(1∶500)进行孵育。所有切片经激光共聚焦显微镜拍照成像，阴性对照缺一抗，未发现免疫阳性产物。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 正常大鼠CD147的表达情况

免疫荧光染色显示：SNL后1、3、7 d，正常大鼠脊髓未见明显免疫荧光染色(图1)；Western blotting显示：与对照组相比，术后1、3、7、14、21和28 d，正常大鼠脊髓非糖基化CD147与糖基化CD147表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)(图2)。

图1 SNL后1、3、7 d正常大鼠脊髓CD147的表达(免疫荧光染色)

图2 SNL后不同时间点正常大鼠脊髓CD147的表达(Western blotting)

2.2 大鼠外周神经损伤后背根神经节CD147及mRNA的表达

免疫荧光染色显示：正常大鼠背根神经节有少量CD147表达，SNL后3 d背根神经节CD147表达明显增高(图3)。Western blotting显示：正常背根神经节内有少量非糖基化CD147及少量糖基化CD147；SNL后背根神经节内非糖基化CD147表达增高，7 d时增至高峰，持续至21 d后下降；而糖基化CD147未见明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)(图4)。RT-PCR显示，与对照组相比，SNL后术侧背根神经节mRNA显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)，14 d增至高峰，持续至28 d；SNL后对侧背根神经节mRNA表达无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)(图5)。

2.3 行为学检测结果

大鼠背根神经节内注射对照RNA或过表达RNA后，对照组大鼠的MWT未见明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)，过表达RNA组大鼠痛域明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)(图6)。大鼠背根神经节内注射对照RNA或干涉RNA后，注射后第14天行SNL模型，观察行为学变化。结果提示：对照组行SNL模型后MWT下降，干涉RNA组痛域亦下降，但仍明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)(图7)。

图3 SNL后3 d背根神经节CD147的表达(免疫荧光染色)

图4 SNL后背根神经节CD147的表达(Western blotting)

图5 SNL后不同时间点背根神经节mRNA表达比较(RT-PCR)

图6 大鼠背根神经节内注射对照RNA或过表达RNA后MWT比较

图7 大鼠背根神经节内注射对照RNA或干涉RNA后MWT比较

3 讨论

NP是一种常见、顽固性疾病，是感觉神经损伤或疾病直接导致的疼痛，以自发性疼痛、痛觉超敏或触诱发痛、痛觉过敏、感觉异常或缺失、伴随异常交感神经系统兴奋性反应为特点，往往在损伤修复或疾病痊愈后数月仍持续存在[8]。NP的发病机制十分复杂，对其治疗效果也不尽人意，因此探索新的治疗方法已成为临床亟待解决的问题之一。

近年研究[9-11]发现，黏附分子的激活可加重NP，而在NP动物神经系统中也发现了一些黏附分子表达增加的现象。CD147是免疫球蛋白超家族成员之一，广泛分布于中枢神经系统，可表达于肿瘤细胞表面，激活邻近的成纤维细胞产生基质金属蛋白酶(MMPs)[12]。Kawasaki等[13]报道，在NP的不同时期MMPs均有致痛作用，拮抗MMPs则能减轻痛觉敏感的发生。作为MMPs的诱导剂，CD147也可能直接参与NP的发生与发展，以其为靶位的免疫治疗可能为疼痛治疗提供有效途径。

本研究通过探讨CD147在大鼠神经损伤后痛觉敏化形成中的作用，结果发现：无论是免疫荧光染色法还是Western blotting法均提示脊髓几乎不表达CD147，且NP发生后脊髓CD147表达仍无明显变化。既往研究[14-15]报道，糖基化的CD147可促进肿瘤的侵袭与转移，而非糖基化的CD147则处于无功能状态。本研究中，对照组背根神经节CD147表达较少，SNL后非糖基化的CD147表达明显增加，而糖基化CD147表达未发生明显变化，说明非糖基化的CD147在NP的发生过程中发挥着重要作用。此外，大鼠背根神经节内注射对照RNA或过表达RNA后，对照组大鼠的MWT未见明显变化，过表达RNA组大鼠痛域明显降低；注射对照RNA或干涉RNA后，对照组MWT下降，干涉RNA组痛域亦下降，但仍明显高于对照组，说明正常大鼠背根神经节内注射过表达CD147 RNA可诱发长时程的机械性痛敏，而注射CD147干涉RNA则能抑制神经损伤后机械性痛敏的发生。

综上所述，外周神经损伤后，大鼠背根神经节内CD147及其mRNA表达均明显上调；CD147过表达可诱发NP，干涉CD147 RNA表达则可抑制其发生。

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The Effect of CD147 on Occurrence and Development of Neuropathic Pain in Rats

Ren Yingna, Su Liwei, Yang Hailong.

Department of Anesthesia Surgery, Baoji Central Hospital, Baoji 721008, China

Objective To explore the effect of CD147 on the formation of pain sensitization after neurological damage in rats. Methods Immunofluorescence staining and Western blotting were used to detect the expression of CD147 in spinal marrow and dorsal root ganglion after spinal nerve ligation (SNL), and real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR) was applied to detect the expression of CD147 mRNA in dorsal root ganglion. The changes of mechanical withdrawal threshold (MWT) were observed after injection of CD147 over-expressed or intervened RNA in dorsal root ganglion of the rats. Results Spinal marrow of normal rats did not express CD147, and there was no obvious change of CD147 expression in spinal marrow after SNL. Dorsal root ganglion in normal rats expressed small amount of CD147, and the expression of both CD147 and mRNA increased obviously after SNL. After injection of contrast RNA or over-expressed RNA in dorsal root ganglion of the rats, there were no significant changes in MWT in the control group (P>0.05), but the pain threshold decreased significantly in the over-expressed RNA group (P<0.05). After injection of contrast RNA or intervened RNA, both MWT of the control group and the pain threshold of the intervened RNA group decreased notably, but the pain threshold of the intervened RNA group was still significantly higher than that of the control group (P<0.05). Conclusion The expressions of CD147 and mRNA in dorsal root ganglion of rats would increase after the damage of peripheral nerves. The over-expression of CD147 can induce neuropathic pain, while the intervention of CD147 RNA expression can effectively inhibit the neuropathic pain.

CD147; Neuropathic pain; Spinal marrow; Dorsal root ganglion; Mechanical withdrawal threshold

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161027.1703.048.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.05.004

中国高校医学期刊临床专项资金(No:11526233)

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