异柠檬酸脱氢酶作为肺癌标志物的临床意义

孙 涛 周喆炎 边 莉 徐开军 马 荟

(云南省第三人民医院病理科，云南 昆明 650011)



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异柠檬酸脱氢酶作为肺癌标志物的临床意义

孙 涛 周喆炎 边 莉1徐开军 马 荟

(云南省第三人民医院病理科，云南 昆明 650011)

目的 探讨异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)作为肺癌标志物的临床意义。方法 RT-PCR检测收集的50例肺癌组织和对应的癌旁组织中IDH1、激活蛋白激酶C1受体(RACK1)、过氧化物氧化还原酶2(PRDX2)的表达水平。ELISA检测收集的50例肺癌患者及20例正常人血浆标本中IDH1的表达水平。以肺癌细胞A549为研究对象，转染IDH1 siRNA抑制肺癌细胞中IDH1的表达，MTT检测转染后1、2、3、4、5、6 d的肺癌细胞增殖情况。流式细胞仪检测转染后48 h的细胞凋亡情况。结果 IDH1、RACK1、PRDX2在肺癌组织中均过度表达，IDH1相对于癌旁组织表达量上调最多。20例正常人血浆中IDH1水平中位数为3.48 U/L，50例肺癌患者血浆中IDH1水平中位数为6.55 U/L，组间比较差异显著(P<0.01)。IDH1 siRNA组肺癌细胞A549细胞存活率与siRNA control组相比差异显著(P<0.05，P<0.01)。siRNA control组细胞凋亡率为0.12±0.01，与IDH1 siRNA组(0.41±0.02)比较差异显著(P<0.01)。结论 IDH1在肺癌组织和血浆中高表达。抑制IDH1可以抑制肺癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡。IDH1可以作为肺癌标志物用于诊断肺癌。

肺癌；异柠檬酸脱氢酶1

肺癌的发生与吸烟、职业、遗传等多种因素有关。肺癌发病早期症状不明显，确诊时一般为肺癌中晚期，耽误了最佳的治疗时机。小分子标志物诊断癌症是目前研究较多的癌症诊断方法。

异柠檬酸脱氢酶(IDH)广泛存在于真核生物体内，是由IDH基因编码的一种蛋白酶〔1〕。IDH1是IDH的一种亚型，在预防应激、胰岛素分泌、射线抵御等方面具有重要作用。已经有研究表明，肺癌组织和正常的癌旁组织中 IDH1、激活蛋白激酶C1受体(RACK1)、过氧化物氧化还原酶2(PRDX2)为差异表达蛋白，而且参与了肿瘤相关信号通路的传导〔2〕。本研究通过对比肺癌细胞中IDH1、RACK1、PRDX2的表达水平，研究其对肺癌细胞的作用，以期为诊断肺癌提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 肺癌组织、血浆样本及细胞系 肺癌组织及对应的正常癌旁组织50例，50例肺癌患者及20例正常人血浆标本均来自2011年7月至2016年7月云南省第三人民医院和昆明医科大第一附属医院，患者已签署知情协议书，组织标本和血浆标本性别年龄均无显著差异。肺癌细胞系A549购于中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。

1.1.2 主要仪器及试剂 CO2培养箱，山东博科生物产业有限公司；超净工作台，北京中科院；倒置显微镜，日本尼康；酶标仪，北京柏迈科技有限公司；水浴锅，上海赫田科学仪器有限公司；离心机，湖南恒诺仪器设备有限公司；反转录试剂盒；RT-PCR检测试剂盒，宝生物工程(大连) 有限公司；Matrigel，上海前尘生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)，杭州四季青有限公司；PBS，碧云天生物技术有限公司；RPMI1640培养基青链霉素胰蛋白酶，上海春晓生物技术有限公司；MTT，上海前尘生物科技有限公司；IDH1酶联免疫检测试剂盒，上海易利生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR检测组织样本中IDH1、RACK1、PRDX2水平 收集的50例肺癌组织和对应的正常癌旁组织随机编号为1～50，每一组取0.2 g组织样本放置于组织研磨管中，加入1 ml的磷酸盐缓冲液(PBS)，匀浆器研磨后转移到离心管中，3 000 r/min离心5 min后，弃上清液。在组织沉淀中加入TRIzol裂解液，充分混匀后，放置于室温下充分裂解6 min，加入200 μl氯仿，震荡混合后置于室温下静置3 min。12 000 r/min，4℃离心5 min，收集上清液。在上清液中加入600 μl的75%乙醇溶液，混匀后10 000 r/min离心5 min，弃上清液，在室温下干燥10 min，加入适量的焦碳酸二乙酯(DEPC)溶解。提取的RNA经反转录试剂盒说明书反转录合成IDH1、RACK1、PRDX2 mRNA，按照荧光定量PCR试剂盒说明书分析IDH1、RACK1、PRDX2转录水平。

1.2.2 ELISA法检测正常人和肺癌患者血浆中IDH1的表达 收集的50例肺癌患者和20例正常人血浆标本，利用双抗体夹心ELISA检测试剂盒检测血浆标本中的IDH1水平。用酶标仪检测每孔的吸光度，波长为450 nm。

1.2.3 细胞培养 取出保存于液氮罐中的肺癌细胞A549，放置于37℃的水浴锅中孵育5 min，观察冻存管中的液体全部融化后，1 000 r/min离心10 min，弃掉上清液。在细胞沉淀中加入2 ml含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基，充分混匀，接种于6孔细胞培养板中，放置于37℃，5%CO2培养箱中培养。观察细胞融合度为90%时，弃细胞生长液，在细胞中加入PBS洗涤细胞两次，加入0.25%胰蛋白酶，放置于37℃，5%CO2培养箱中消化3 min，观察细胞呈单个存在时，加入细胞培养液，1 000 r/min离心10 min，弃酶消化液，加入PBS洗涤细胞后，加入细胞生长液，接种于细胞培养板中继续培养。

1.2.4 细胞转染 取对数生长期的肺癌细胞A549，加入0.25%胰蛋白酶消化细胞呈单个细胞，加入PBS洗涤细胞两次，放置于37℃，5%CO2培养箱中培养，待细胞融合度达到85%时，将细胞生长液更换为不含胎牛血清的不完全培养液，放置于37℃，5%CO2培养箱中孵育1 h。用不含胎牛血清的不完全培养液分别与IDH1 siRNA和siRNA control混合后，室温下静置5 min，为A液。转染试剂与不完全培养液混合后，在室温下静置20 min，为B液。A液与B液混合后，室温下静置20 min，与细胞混合后，放置于37℃，5%CO2培养箱中培养6 h，更换为含有胎牛血清的完全培养液，继续培养48 h。

1.2.5 MTT检测细胞增殖 转染IDH1 siRNA和siRNA control后的肺癌细胞A549，加入胰蛋白酶消化细胞后，用PBS洗涤细胞，1 000 r/min离心5 min，加入细胞培养液，接种于96孔细胞培养板中，调整每孔中细胞个数为20 000个，放置于37℃，5%CO2培养箱中培养4 h后，待细胞贴壁后，弃细胞生长液，更换新的细胞生长液，培养时间分别为1、2、3、4、5、6 d。加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，在37℃培养箱中孵育4 h，吸除上清液，加入150 μl的DMSO溶液，避光条件下反应10 min，直至结晶物完全溶解后，酶联免疫检测仪检测各孔的吸光度(OD值)，分析细胞增殖情况。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 转染IDH1 siRNA和siRNA control后的肺癌细胞A549培养48 h后，弃去细胞生长液，在细胞中加入0.25%胰蛋白酶消化细胞后，1 000 r/min离心细胞10 min，在细胞沉淀中加入PBS悬浮细胞后，1 000 r/min离心10 min，加入细胞生长液，使得每毫升细胞悬浮液中含有2×106个细胞。取1 ml的细胞悬浮液，2 000 r/min离心10 min，弃上清液，收集细胞沉淀，加入适量的结合缓冲液后，在细胞中加入5 μl Annexin V和5 μl PI混合，室温下孵育反应10 min后，流式细胞仪检测每组细胞凋亡情况。

1.3 统计学方法 应用SPSS22.0统计学分析软件对数据的组间比较行方差分析。

2 结 果

2.1 RT-PCR检测组织样本中IDH1、RACK1、PRDX2水平 以正常的癌旁组织中IDH1、RACK1、PRDX2水平为参照(设为1)，IDH1、RACK1、PRDX2在肺癌组织中均过度表达(分别为3.09±0.15，2.16±0.17，2.20±0.11)，IDH1相对于癌旁组织表达量上调最多，故选用IDH1进行后续研究。

2.2 ELISA检测肺癌患者和正常人血浆中IDH1水平 20例正常人血浆中IDH1水平中位数为3.48 U/L，50例肺癌患者血浆中IDH1水平中位数为6.55 U/L，组间比较差异显著(P<0.01)。见图1。

图1 正常人和肺癌患者血清中IDH1含量

2.3 MTT检测细胞增殖结果 IDH1 siRNA组肺癌细胞A549细胞存活率与siRNA control组相比差异显著(P<0.05，P<0.01)。转染IDH1 siRNA可抑制细胞中IDH1的表达，进而有效抑制肺癌细胞的增殖。见表1。

2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 IDH1 siRNA组的肺癌细胞凋亡率为(0.41±0.02)，明显多于siRNA control组(0.12±0.01，P<0.05)。可见，抑制IDH1的表达可以有效促进肺癌细胞A549，凋亡。

表1 MTT检测转染后的肺癌细胞A549增殖情况

与siRNA control组比较:1)P<0.05，2)P<0.01

3 讨 论

据世界卫生组织统计，世界范围内每年大约有160万新增肺癌患者，有140万人死于肺癌，肺癌的死亡人数占恶性肿瘤死亡人数的19%。在中国，肺癌的发病率和死亡率均为恶性肿瘤中的第一位，其中城市肺癌的死亡率较农村高，男性的死亡率较女性高。肺癌发病隐匿，约有70%的肺癌患者确诊时已经为肺癌晚期。

分子标记物在多种疾病的诊断中已经得到广泛应用。癌症标志物在正常组织和癌症组织中差异表达，可以是癌基因、抑癌基因或者与癌症相关的基因、抗原〔3～5〕，在肿瘤的诊断中具有监测作用。

IDH1基因在人类染色体2q33上，细胞质内的IDH1可以促进NADPH产生，从而诱导谷胱甘肽的循环再生〔6〕。IDH1参与细胞代谢，在与葡萄糖相关的胰岛素分泌中具有调控作用〔7，8〕。已经有研究表明，IDH1、RACK1、PRDX2在肺癌组织和癌旁组织中差异表达〔9〕。本研究结果显示，IDH1在肺癌组织中表达上调最为明显，并且肺癌患者血浆中IDH1含量明显高于正常人。抑制细胞中IDH1的表达，可以有效抑制肺癌细胞的增殖，并且明显促进肺癌细胞凋亡。

综上所述，IDH1在肺癌组织中过度表达，发挥癌基因的作用。抑制IDH1的表达可以抑制肺癌细胞的增殖，促进肺癌细胞凋亡。这说明IDH1是一种潜在的肺癌标志物，为诊断和治疗肺癌提供了新思路。

1 Chotirat S，Thongnoppakhun W，Wanachiwanawin W，etal.Acquired somatic mutations of isocitrate dehydrogenases 1 and 2(IDH1，and IDH2) in preleukemic disorders〔J〕.Blood Cells Mol Dis，2015；54(3)：286-91.

2 Stein EM.IDH2 inhibition in AML：finally progress〔J〕.Best Pract Res Clin Haematol，2015；28(2-3)：112-5.

3 田 侠，刘爱军，曹 晨，等.分子标志物在子宫内膜癌中的表达分析〔J〕.现代生物医学进展，2015；15(10)：1891-4.

4 Braunschweig T，Chung JY，Choi CH，etal.Assessment of a panel of tumor markers for the differential diagnosis of benign and malignant effusions by well-based reverse phase protein array〔J〕.Diag Pathol，2015；10(1)：1-10.

5 Naka T，Hatanaka Y，Marukawa K，etal.Comparative genetic analysis of a rare synchronous collision tumor composed of malignant pleural mesothelioma and primary pulmonary adenocarcinoma〔J〕.Diag Pathol，2016；11(1)：38.

6 Reitman ZJ，Sinenko SA，Spana EP，etal.Genetic dissection of leukemia-associated IDH1 and IDH2 mutants and D-2-hydroxyglutarate in Drosophila〔J〕.Blood，2015；125(2)：336-45.

7 Stancheva G，Goranova T，Laleva M，etal.IDH1/IDH2 but not TP53 mutations predict prognosis in Bulgarian glioblastoma patients〔J〕.Biomed Res Int，2014；2014(1)：251-78.

8 Cimino PJ，Kung Y，Warrick JI，etal.Mutational status of IDH1 in uveal melanoma〔J〕.Exp Mol Pathol，2016；100(3)：476-81.

9 孙 楠.异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)作为新的非小细胞肺癌标志物的研究〔D〕.北京：北京协和医学院，2014.

〔2015-12-17修回〕

(编辑 袁左鸣)

云南省教育厅科学研究基金项目(2010Y188)

孙 涛(1968-)，女，副主任医师，主要从事肺、乳腺肿瘤研究。

R734.2

A

1005-9202(2016)21-5337-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.056

1 昆明医科大学第一附属医院病理科