穴位注射脂肪来源基质血管成分抗皮肤老化的作用

包春铭 黄金龙 朱萱萱 刘 宁 陆金春 姚 昶

(南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210029)



穴位注射脂肪来源基质血管成分抗皮肤老化的作用

包春铭 黄金龙1朱萱萱2刘 宁1陆金春3姚 昶4

(南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210029)

目的 探讨穴位注射脂肪来源基质血管成分(SVF)抗皮肤老化的作用。方法 将18个月的老龄大鼠分为模型组、针灸组、SVF注射组和针灸SVF组，将10月大鼠设为对照组，每组10只。各组的给药方式分别为对照组皮下注射0.9%氯化钠注射液；针灸组针刺足三里穴位；SVF注射组：皮下注射0.5 ml SVF细胞悬液；针灸SVF组针刺足三里穴位0.5 ml SVF细胞悬液。所有组别连续给药22 d。治疗结束检测背部皮肤显微特征、皮肤的超氧化歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和羟脯氨酸(HYP)和皮肤标本DiI荧光染色吸光度。结果 SVF细胞数量为(1.05±0.7)×106。与对照组比，衰老模型组的表皮和真皮厚度明显降低(P<0.05)，与衰老模型组比，穴位注射组、SVF注射组和针灸SVF组的表皮和真皮厚度均有不同程度的增加，针灸SVF组的表皮和真皮厚度的增加存在显著差异(P<0.05)。对照组表皮完整，真皮见少许血管，大量胶原纤维组成致密结缔组织。皮脂腺汗腺及毛囊清晰可见；衰老模型组皮肤尚完整，真皮内少许血管，胶原纤维疏松，皮脂腺汗腺和毛囊不完整；穴位注射组、SVF组及针灸SVF组均可见真皮内可见细长的血管向表皮延伸。与对照组比，衰老模型组的MDA明显增高(P<0.05)，SOD和HYP明显降低(P<0.05)，与衰老模型组比，穴位注射组、SVF注射组和针灸组的MDA有不同程度的降低，SOD和HYP有不同程度的增高，针灸SVF组的MDA降低与SOD和HYP增高均具有显著差异(P<0.05)，对照组、衰老模型组和穴位注射组的DiI荧光吸光度较低，SVF注射组和针灸SVF组的DiI荧光吸光度较高(P<0.05)，与SVF注射组比，针灸SVF组的DiI荧光吸光度较高(P<0.05)。结论 足三里穴位注射SVF具有明显的抗皮肤老化作用。

穴位注射；脂肪来源基质血管成分(SVF)；皮肤老化

皮肤老化(SA)是伴随人体衰老进程的一个外在标志，与年龄和日光照射相关，除了影响外在美观，如皮肤松弛、色斑增多或肤色灰黄，还与恶性良性肿瘤的发生有关〔1,2〕。穴位注射是20世纪50年代兴起的中西医结合疗法，属于针灸范畴，因具有除简便、廉价和无副作用外，还具有调和阴阳、疏通经络和扶正祛邪的特点，因此一直以来在保健驻颜方面占有重要且不可替代的优势〔1〕。自体脂肪组织是理论上最理想的软组织填充材料来源，脂肪组织中的血管基质成分是脂肪经消化、过滤祛除成熟的脂肪组织得到且包括如内皮前体细胞、间充质干细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞等多种细胞成分，可诱导分化为脂肪组织、成软骨细胞和成骨细胞，自1893年开始至今脂肪来源基质血管成分(SVF)用于治疗软组织缺损已超过一百年〔2〕。本课题拟采用自然老龄大鼠为老化皮肤模型，考察穴位注射SVF是否具有抗SA的作用，并为穴位注射SVF的临床应用提供参考。

1 动物与方法

1.1 受试动物 18月龄SD 雌性大鼠和10月龄SD雌性大鼠，SPF级，体重(450±20)g和(220±20)g，由江苏省中医院实验动物中心提供，合格证号：SYXK(苏)2012-0047，自由摄食饮水，12 h人工光照。

1.2 仪器和试剂 6805D电针仪购于汕头市医用设备厂有限公司，DS-1匀浆机购于上海净信实验设备科技部，WFZ-26A紫外分光光度计购于天津市新天光分析仪器技术公司，DYS-805倒置显微镜购于上海点应光学仪器有限公司，PB300高速离心机购于张家港市翔宇离心机制造有限公司，手术用的医疗器械。DMEM，购于美国GIBCO公司，DiI应用液购于美国Molecular Probe Inc公司，红细胞裂解液、猴抗山羊和CD34、CD90山羊源性单克隆抗体异硫氰酸荧光素(FITC)购于美国 Sigma 公司，96孔细胞培养板购自美国 Corning 公司，硫化钠和苏木素-伊红(HE)试剂均购于市化工试剂厂。

1.3 SVF的制备与鉴定

1.3.1 SVF的制备 在无菌条件下，取SD大鼠，全麻后取腹股沟部脂肪垫，取腹股沟部脂肪垫的大鼠均分至SVF注射组和针灸SVF组，其余组别，全麻后暴露腹股沟即可。将取出的脂肪垫剔除血管和纤维，剪成1 mm3的小块，按1∶1加入0.1%Ⅰ型胶原酶溶液于37℃恒温摇床中消化60 min，震荡混匀3次，加入完全培养基(DMEM+10%胎牛血清+1%双抗)中和，离心吸除悬浮的上层脂滴、次层乳状成熟脂肪细胞，再离心留下底层沉淀，沉淀用红细胞裂解液(154 mmol/L NH4Cl+10 mmol/L KHCO3+0.1 mmol/L 乙二胺四乙酸)处理，去除红细胞碎片，DMEM重悬沉淀，200目筛网过滤，得到SVF细胞悬液。将SVF细胞接种于24孔板内L-多聚赖氨酸预包被的盖玻片上，37℃预热的磷酸盐缓冲液(PBS)洗去培养基，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗5 min×3次。加入0.1%triton溶液，室温作用30 min，PBS洗涤5 min。4%胎牛血清(BSA)于37℃封闭20 min，甩干，分别加入CD34、CD90山羊源性单克隆抗体(CD34检测内皮细胞，CD90检测干细胞)，设置 PBS 阴性对照，置4℃冰箱孵育过夜。PBS 冲洗5 min×3 次，加入猴抗山羊FITC二抗，37℃作用45 min，PBS 液漂洗5 min×3 次。

1.3.2 SVF活力检测 取SVFs悬液置入试管中，加入等量0.4%台盼蓝染液，混匀，染色2 min，细胞计数板计数，倒置显微镜下见深蓝色细胞为死细胞，活细胞不被染色，计算细胞成活率。见图1。

图1 显微镜SVF细胞(×100)

1.3.3 计数 将SVFs悬液滴至计数板，采用血球计数板细胞计数法进行计数，压线细胞只记左侧和上方细胞。

1.3.4 标记 移植前取新鲜分离的SVF沉淀加入无血清的DMEM制成细胞悬液，每1×106细胞加入5 μl DiI应用液于37℃ 5% CO2培养箱中孵育25 min，PBS清洗离心2次，再以PBS重悬，制成DiI标记的SVF细胞悬液备用。

1.4 分组及给药 18个月大鼠即为老年大鼠。将老年大鼠分为，模型组、针灸组、SVF注射组和针灸SVF组，将10月龄大鼠设为对照组，每组10只。各组的给药方式分别为对照组皮下注射0.9%氯化钠注射液；针灸组针刺足三里穴位；SVF注射组：皮下注射0.5 ml SVF细胞悬液；针灸SVF组针刺足三里穴位0.5 ml SVF细胞悬液。针刺足三里穴位：定位取穴参照《实验针灸学》，即膝关节后外侧，腓骨小头下，用1 cm的毫针在大鼠双侧“足三里”进针5～7 mm，留针行针约5 min。所有组别连续给药22 d。

1.5 方法及指标

1.5.1 背部皮肤显微特征 治疗结束第2天，8%硫化钠颈背部皮肤脱毛，脱椎处死，立即取背部正中皮肤约1.0 cm×1.0 cm方形，剔除脂肪组织，置于中性甲醛溶液中固定，采用HE染色，测量真皮和表皮厚度，记录皮肤显微。

1.5.2 皮肤的超氧化歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和羟脯氨酸(HYP)检测 取颈背部皮肤组织，除去皮下脂肪和结缔组织，剪刀剪碎并研钵成皮肤匀浆。采用考马斯亮蓝法检测匀浆中SOD、MDA和HYP水平。

1.5.3 皮肤标本荧光染色 切取各组0.5 cm×0.5 cm大小的老化皮肤组织，30%蔗糖溶液脱水，OCT试剂包埋样本组织制成10 μm的冰冻切片，荧光显微镜下观察DiI荧光显色情况。

1.6 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行方差分析或χ2检验。

2 结 果

2.1 不同组别的皮肤显微比较 SVF细胞数量为(1.05±0.7)×106。与对照组比，衰老模型组的表皮和真皮厚度明显降低(P<0.05)，与衰老模型组比，穴位注射组、SVF注射组和针灸SVF组的表皮和真皮厚度均有不同程度的增加，针灸SVF组的表皮和真皮厚度的增加存在显著差异(P<0.05)。对照组表皮完整，真皮见少许血管，大量胶原纤维组成致密结缔组织。皮脂腺汗腺及毛囊清晰可见；衰老模型组皮肤尚完整，真皮内少许血管，胶原纤维疏松，皮脂腺汗腺和毛囊不完整；穴位注射组皮肤完整，真皮内可见少许细长血管向表皮延伸，大量胶原纤维组成致密结缔组织。皮脂腺汗腺及毛囊清晰可见；SVF注射组可见表皮完整，真皮内可见少许细长血管向表皮延伸，大量胶原纤维组成致密结缔组织。皮脂腺汗腺及毛囊清晰可见；针灸SVF组可见表皮完整，真皮内可见细长的血管向表皮延伸，大量胶原纤维组成致密结缔组织。皮脂腺汗腺及毛囊清晰可见。见表1，图2。

表1 不同组别的皮肤厚度比较

与对照组比较：1)P<0.05，与衰老模型组比较：2)P<0.05，与穴位注射组比较：3)P<0.05，与SVF注射组比较：4)P<0.05；下表同

2.2 不同组别的皮肤SOD、MDA、HYP和DiI荧光吸光度水平比较 与对照组比，衰老模型组的MDA明显增高(P<0.05)，SOD和HYP明显降低(P<0.05)，与衰老模型组比，穴位注射组、SVF注射组和针灸SVF组的MDA不同程度降低，SOD和HYP有不同程度的增高，针灸SVF组的MDA降低与SOD和HYP增高均具有显著差异(P<0.05)，对照组、衰老模型组和穴位注射组的DiI荧光吸光度较低，SVF注射组和针灸SVF组的DiI荧光吸光度较高(P<0.05)，与SVF注射组比，针灸SVF组的DiI荧光吸光度较高(P<0.05)。见表2，图3。

图2 不同组别的皮肤显微比较(×100)

组别SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)HYP(U/mgprot)Dil荧光吸光度对照组265.3±52.676.5±19.5275.4±24.50.2±0.1衰老模型组169.8±46.71)152.4±26.91)245.6±24.11)0.2±0.1穴位注射组211.6±51.4106.5±14.82)306.8±26.42)0.1±0.1SVF注射组234.6±42.62)103.9±1.572)309.4±27.72)0.5±0.22)3)针灸SVF组256.4±43.32)3)4)82.4±16.82)3)4)375.4±21.42)3)4)0.8±0.32)3)4)F/P值6.5/<0.0524.1/<0.0528.1/<0.0525.9/<0.05

图3 不同组别的皮肤DiI荧光吸光度比较

3 讨 论

中医认为，脾经、胃经、任脉和督脉是临床最常用的经脉，其中胃经足三里是保健穴中应用比较多的穴位，大量研究显示足三里穴是延缓衰老临床治疗的主要穴位。

人体的气血生化之源是脾胃，脾胃也被称为“后天之本”，人的一切生命活动和生长发育都有赖于脾胃之运化，胃经善调气血，可双向调节脾胃，平衡整体的气血阴阳，胃经的本质是抗衰老的重要经脉，足三里是胃经的重要穴位之一，也是抗衰老的常用穴位。《灵柩》有云“阴阳俱有余，若皆不足，则有寒有热，皆调于三里”。《医说》有云，“若要安，三里莫要干”。《外台秘要》有云“三里养先后天之气，灸三里可使元气不衰，故称长寿之灸”。《通玄指要赋》有云“三里却五劳之羸瘦”，以上均证明了针灸足三里的保健抗衰老的作用〔3～6〕。自由基衰老学说逐渐成为衰老理论中的核心理论：紫外线照射使皮肤组织内产生大量氧自由基(·O2-、H2O2和·OH-等)，使组织抗氧化防御体系能力减弱，侵害细胞膜中的不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化反应，形成过氧化脂质，脂质过氧化物的降解产物MDA与氨基酸、核酸、蛋白质和磷脂等和游离氨基反应形成脂自由基，它广泛地参与机体的生理与病理过程。诸多研究也显示给老年大鼠针刺足三里保健抗衰老和抗皮肤老化的机理在于抗氧化和清除自由基：如李映霞等对老化模型采用针刺足三里，结果显示针刺足三里对无毛小鼠皮肤光老化具有显著的保护作用，与足三里具有清除MDA，提高SOD和HYP活力达到抗氧化目的有关〔7～9〕。本课题结果也显示，针刺足三里可以降低衰老大鼠皮肤的MDA水平，提高HYP含量，增强SOD活力，与文献结果相似。

SVF是脂肪组织经过胶原酶的消化得到的多种细胞的复合体，该复合体含有脂肪干细胞，脂肪干细胞具有多向分化的能力，如分化为血管内皮细胞、脂肪细胞或骨细胞，其中分化的内皮细胞具有促进血管生成，改善血管功能；复合体还可分泌多种生长因子和细胞因子，这些因子有助于促进血管形成与组织修复〔10～12〕。本课题结果显示，与对照组比，皮下注射SVF 和“足三里”注射SVF均有助于增加衰老皮肤的真皮和表皮厚度，改善衰老皮肤的血管和结构，使皮肤年轻化，且DiI荧光吸光值也显示了上述改善作用的物质基础是SVF。综上所述，足三里注射SVF具有明显的抗SA作用，与针刺足三里穴位清除氧自由基、提高SOD活力、促进胶原蛋白生成、SVF促进衰老皮肤血管生成、改善血管功能有关，但针刺足三里具有促进衰老皮肤血管生成的作用效果不及SVF皮下注射，其中原因仍不明确。

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〔2016-02-11修回〕

(编辑 袁左鸣)

国家自然科学基金(No.81373646)；江苏省高校优势学科建设项目Ⅱ期(012062003010)

姚 昶(1967-)，男，博士，主任医师，主要从事创伤修复研究。

包春铭(1981-)，男，硕士，主治医师，主要从事脂肪干细胞的实验研究和临床应用转化研究。

R75

A

1005-9202(2016)21-5224-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.004

1 南京中医药大学附属医院整形外科

2 南京中医药大学附属医院动物实验中心

3 武警江苏总队南京医院检验科

4 南京中医药大学附属医院乳腺外科