慢性缺血致血管性认知障碍大鼠脑白质病变与Ephrin-B3的相关性

赵 腾 丁 颖 王 超 周春奎

(吉林大学第一医院二部，吉林 长春 130031)



慢性缺血致血管性认知障碍大鼠脑白质病变与Ephrin-B3的相关性

赵 腾 丁 颖 王 超 周春奎

(吉林大学第一医院二部，吉林 长春 130031)

目的 探讨Ephrin-B3是否参与了慢性脑缺血大鼠的脑白质损害及认知功能障碍。方法 选用 Wistar 大鼠48只，随机分为假手术1组、假手术2组、模型30 d组、模型60 d组。模型组组应用大鼠双侧颈总动脉永久结扎法(2VO)制备慢性前脑缺血致血管性痴呆动物模型，假手术组仅有手术过程而未行双侧颈总动脉结扎。术后30 d，采用Morris水迷宫对假手术1组及模型30 d组大鼠于手术前及手术后的逃避潜伏期时间进行检测，比较手术前后及各组间的差异。而后将2组大鼠断头取脑。部分行HE染色，部分脑组织制成匀浆，行ELISA 检测，统量各组Ephrin-B3的表达。术后60 d，按照上述同样的方法对假手术2组及模型2组大鼠进行处理。结果 造模后30 d，模型1组大鼠水迷宫的逃避潜伏期时间与假手术1组相比差异显著(P<0.05)；造模后60 d，模型2组大鼠水迷宫的逃避潜伏期时间与假手术2组相比差异显著(P<0.05)，说明模型组大鼠学习记忆能力均明显降低。经HE染色，发现缺血30 d及60 d组大鼠胼胝质部位出现明显白质疏松、细胞数量减少，并出现空泡样改变。经ELISA检测，假手术1组、模型30 d组、假手术2组、模型60 d组大鼠脑内Ephrin-B3浓度分别为(11.76±1.26)ng/ml、(12.08±1.32)ng/ml、(37.25±5.32)ng/ml、(48.65±6.88)ng/ml。模型30 d组与假手术1组Ephrin-B3表达量相比差异显著(P<0.05)；模型2组与假手术2组相比差异显著(P<0.05)。结论 Ephrin-B3可能参与了慢性缺血致血管性痴呆大鼠的脑白质损害及认知功能障碍。

血管性痴呆；脑白质病变；Ephrin-B3

血管性认知障碍(VCI)是指由脑血管疾病引起的脑损害所致的认知障碍，慢性脑缺血是最常见的原因之一。VCI患者认知损害的特征主要为执行功能损害，也可以表现为记忆力损害〔1〕。目前研究认为记忆力障碍主要与海马功能损害有关，而执行功能障碍主要与皮层下白质损害有关〔2〕。脑白质病变是VCI的主要病理变化，包括髓鞘脱失、轴突变性及神经纤维断裂。Ephrin-B3主要为少突胶质细胞表达的一种髓鞘生长相关抑制因子(MAIFs)，在髓鞘损伤后修复及抑制轴突再生的过程中起到关键作用。慢性脑缺血后脑白质出现的一系列病理变化可能伴随着Ephrin-B3的表达变化。本研究探讨Ephrin-B3是否参与了慢性缺血后VCI的发生。

1 材料和方法

1.1 实验动物 选取雄性Wistar大鼠48只，250～300 g，由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供及喂养，实验动物生产许可证：SCXK(吉)2014-0006，实验动物使用许可证：SYXK(吉)2014-0018，实验在吉林大学基础实验室进行。

1.2 实验动物分组及模型制备 48只Wistar大鼠在分组前都要进行Morris 水迷宫实验筛选，统计大鼠的训练成绩，淘汰游泳能力差或智力低下的大鼠。按随机数字表法分为缺血模型组和假手术组，每组24只。缺血模型组在手术后又分为 30 d、60 d亚组，每组12 只(6只用于HE染色；6只用于ELISA)。术后死亡的大鼠被剔除，并随时补足相应数目的动物。大鼠称重，10%水合氯醛300 mg采用双侧颈总动脉永久结扎方法(2OV)制备慢性脑缺血动物模型。

1.3 水迷宫检测及样本制备 造模后30 d，对各组大鼠进行水迷宫试验，4次/d，2 min/次，共5 d，记录其逃避潜伏期。而后对假手术组随机抽取12只及12只30 d缺血模型组大鼠用 10%水合氯醛麻醉，之后在冰盘上快速断头取脑。各组随机抽取6只，用4%多聚甲醛后固定16 h，30%蔗糖溶液浸泡至标本下沉，锡箔纸包裹，-70℃冰箱保存，-20℃恒冷切片机上连续冠状切片，片厚20 μm，制成冰冻切片。采用石蜡包埋的方法制备石蜡切片。各组剩余6只将取出脑组织置于玻璃匀浆器中研磨，2 000 r/min离心15 min，留取上清。无菌条件下过滤，-80℃保存备用。造模后60 d，按照同样方法将假手术组剩余12只及60 d 缺血模型组大鼠断头取脑，进行苏木素-伊红(HE)染色及提取脑匀浆上清。

1.4 Ephrin-B3的检测方法 标准品按以下浓度备比稀释48、24、12、6、3、1.5 ng/ml。大鼠Ephrin-B3抗体，产地：上海，规格1.0 g。设定空白孔、标准品孔及样品孔。将稀释后的不同浓度标准品加入标准品孔中，在样本孔内先加入10 μl待测样本，然后用稀释液稀释5倍，空白孔不加。在各样本孔和标准品中每孔均加入100 μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体，封板膜密封，37℃水浴60 min。弃去液体后拍干，加洗涤液300 μl/孔，静置1 min后拍干，如此重复5次，然后拍干。分别加入底物A和底物B 50 μl/孔，37℃避光孵育15 min。取出酶标板，加终止液终止反应50 μl/孔。以空白孔调零，在450 nm波长下测量各孔的吸光度值(OD值)。终止后15 min内检测完成，以标准品的浓度和OD值作标准曲线，然后根据样品的OD值和标准曲线所对应的公式计算出Ephrin-B3的浓度值即可。

1.5 统计学方法 应用SPSS13.0统计学分析软件对数据的组间比较进行方差分析。

2 结 果

2.1 Morris水迷宫结果 见表1，表2。

2.2 胼胝体HE染色 在假手术组大鼠的胼胝体并未发现白质疏松，细胞沿轴突较规则地排列，纤维排列相对整齐。而在缺血模型组大鼠胼胝体中可观察到不同程度的脑白质疏松，纤维排列凌乱，细胞数量减少，可见空泡样改变，随着缺血时间的延长，上述改变逐渐加重。见图1。

表1 造模前水迷宫逃避潜伏期时间比较

表2 造模后水迷宫逃避潜伏期时间比较

图1 各组大鼠胼胝体HE染色(×40)

2.3 Ephrin-B3检测结果 Ephrin-B3水平假手术1组为(11.76±1.26)ng/ml；假手术2组为(12.08±1.32)ng/ml；30 d组为(37.25±5.32)ng/ml；60 d组为(48.65±6.88)ng/ml。30 d组及60 d组分别与假手术组相比，差异显著(t=6.125、7.286，P<0.05)；而60 d组与30 d组相比也有显著差异(t=1.89，P<0.05)。

3 讨 论

执行功能障碍突出被认为是VCI区别于其他类型认知障碍的特点之一，而执行功能障碍主要与皮层和皮层下结构联系功能障碍有关〔2〕，因此认为，皮层下白质损害与VCI关系密切。

有研究显示慢性缺血是导致VCI的常见原因之一，慢性脑缺血的组织病理学改变包括皮质及海马萎缩及神经元变性、脑白质疏松、胶质细胞增生和毛细血管床减少等〔3〕。而脑白质疏松的主要表现是少突胶质细胞凋亡导致的髓鞘脱失以及轴突变性，从而导致神经纤维脱失。既往大量研究显示通过促进少突胶质细胞存活可以使损伤或脱失的髓鞘得到修复，而轴突一旦损伤后其修复及再生则非常困难。其原因并非轴突不可再生，而是由轴突周围的少突胶质细胞形成的髓鞘内存在抑制轴突再生的众多因子，即MAIFs，主要包括Nogo蛋白、OMgP蛋白、MAG蛋白及后期发现的Ephrin蛋白，其中Ephrin-B3被认为是作用更为明显的轴突生长抑制因子〔4，5〕。Ephrin-B3是促红细胞生成素诱导的肝细胞受体(Eph)家族成员之一，在正常生理状况下处于低表达水平，但当出现神经损伤时，在相应突触及少突胶质细胞中即可大量表达，其主要功能为维护髓鞘的完整及抑制轴突的再生。目前Ephrin-B3与脊髓损伤后的修复的相关性研究较为集中〔6〕，其与VCI的相关性研究国内外尚未见报道。但从VCI的病理学变化来看，Ephrin-B3可能通对缺血后损伤的白质内轴突的再生产生抑制，从而加重认知功能的损害。本研究结果证明Ephrin-B3参与了慢性缺血所致的脑白质损伤，进而引起认知功能障碍。

1 Lopez-Valdes HE，Clarkson AN，Ao Y，etal.Memantine enhances recovery from stroke〔J〕.Stroke，2014；45(7)：2093-100.

2 Bird CM，Burgess N.The hippocampus and memory：insights from spatial processing〔J〕.Nat Rev Neurosci，2008；9(3)：182-94.

3 Lee JH，Parka SY，Shin YW，etal.Concurrent administration of cilostazol with donepezil effectively improves cognitive dysfunction with increased neuroprotection after chronic cerebral hypoperfusion in rats〔J〕.Brainres，2007；1185(4)：246-155.

4 Harvey PA，Lee DH，Qian F，etal.Blockade of Nogo receptor ligands promotes functional regeneration of sensory axons after dorsal root crush〔J〕.J Neurosci，2009；29(19)：6285-95.

5 Benson MD，Romero MI，Lush ME，etal.Ephrin-B3 is a myelin-based inhibitor of neurite outgrowth〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2005；102(30)：10694-9.

6 Qu Y，Zhao J，Wang Y，etal.Silencing ephrinB3 improves functional recovery following spinal cord injury〔J〕.Mol Med Rep，2014；9(5)：1761-6.

〔2015-11-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

吉林大学第一医院二部专项基金(A03)

周春奎(1962-)，男，教授，硕士生导师，主要从事脑血管病与痴呆的研究

赵 腾(1985-)，男，主治医师，主要从事脑血管病与痴呆的研究。

R743

A

1005-9202(2016)21-5245-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.013