铁皮石斛多糖对糖尿病大鼠视网膜炎症因子表达干预的研究

李静文 李国文 秦瑜 李春霞

铁皮石斛多糖对糖尿病大鼠视网膜炎症因子表达干预的研究

李静文1李国文2秦瑜2李春霞2

目的观察铁皮石斛多糖（PDC）对糖尿病大鼠视网膜及血清中炎症因子表达水平的影响，探讨PDC在早期糖尿病视网膜病变中的抗炎作用及机制。方法采用链脲佐菌素（STZ）腹腔注射的方法诱导SD大鼠糖尿病模型。模型建立成功6周后，分别用低剂量PDC[100 mg/（kg·d）]、中剂量PDC[200 mg/（kg·d）]及高剂量PDC[300 mg/（kg·d）]灌胃治疗。8周后，2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，取所需标本。采用蛋白印迹法（Westen Blot）检测大鼠视网膜内白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大鼠血清IL-6、TNF-α的含量，免疫组化观察大鼠视网膜内核转录因子κB（NF-κB）的表达水平。结果与正常组比较，糖尿病组大鼠视网膜内IL-6、TNF-α、VEGF的蛋白表达增加；血清IL-6、TNF-α表达增加，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。与糖尿病组比较，PDC低、中、高各剂量组大鼠视网膜内IL-6、TNF-α的蛋白表达明显降低，血清IL-6、TNF-α的表达降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。PDC各剂量组之间各指标两两比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。免疫组化切片观察，正常大鼠视网膜未见明显NF-κB阳性染色，糖尿病组大鼠视网膜内NF-κB表达高于正常组，与糖尿病组比较，PDC各剂量组NF-κB表达降低。结论PDC可以降低糖尿病视网膜病变大鼠体内炎症因子（IL-6、TNF-α）的表达，进而抑制VEGF表达上调。其作用机制可能与NF-κB通路有关。

糖尿病视网膜病变；PDC；炎症因子；NF-κB

多项研究证实，糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy DR）是一种慢性亚临床低度炎症性疾病〔1〕。早期改变以白细胞黏附、聚集及移行、血管通透性增加、血-视网膜屏障（blood-retina barrier，BRB）破坏为病理特征，最终诱导VEGF表达上调，促使视网膜内新生血管的形成〔2〕，进一步加速DR的恶化，影响患者视力。因此，对DR患者早期进行抗炎治疗有可能为预防DR进一步发展及治疗提供一个新的思路。石斛作为传统名贵中草药具有低毒性的特性，其化学成分和药理活性逐渐引起人们的关注，多糖是石斛属植物中主要的药用活性成分之一，研究表明铁皮石斛多糖（polysaccharides of dendrobium candidum，PDC）提取物具有抗炎作用〔3〕。为此，我们观察PDC对糖尿病大鼠视网膜及血清中炎症因子表达水平的影响，探讨PDC应用于DR的抗炎作用及机制，为DR的防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠50只，雄性，体质量120～160 g，购自上海市斯莱克动物实验公司。

1.2 药品与试剂

PDC购自长沙中仁生物有限公司，褐色粉状，经上海中医药大学药理实验室鉴定多糖含量50%。使用前用生理盐水分别溶解为25 mg/ml、50 mg/ml、75 mg/ml。链脲佐菌素（STZ）（美国sigma公司）、血糖仪及试纸（美国强生公司）、单克隆兔抗肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体，单克隆兔抗白细胞介素-6（IL-6）抗体（英国Abcam公司），单克隆兔抗血管内皮生长因子（VEGF）抗体（美国Santa Cruz公司），兔抗大鼠核转录因子κB（NF-κB）p65抗体（美国Sigma公司），大鼠IL-6、TNF-α ELLSA试剂盒（欣博盛生物科技有限公司）。

1.3 实验分组

将实验动物随机分为正常组、糖尿病组、PDC低剂量组、PDC中剂量组、PDC高剂量组，每组10只。

1.4 造模及标本提取方法

50只雄性SD大鼠适应性喂养1周后，禁食不禁水12 h，新配制的链脲佐菌素溶液按照55 mg/kg的剂量，对糖尿病组、PDC低剂量组、PDC中剂量组、PDC高剂量组行腹腔注射，正常组大鼠行等量柠檬酸钠缓冲液腹腔注射。72 h后尾静脉取血测血糖，如血糖≥16.7 mmol/L则认为糖尿病大鼠模型成功。造模成功后，不用胰岛素及其它任何药物干预，不控制饮食饮水。喂养6周后，PDC低、中、高各剂量组予PDC灌胃，剂量分别为100、200、300 mg/（kg·d）；正常组和糖尿病组等量灌胃生理盐水。标本提取和各项试验在药物干预8周后进行。

1.5 实验方法及检测指标

取所需试验鼠，腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，开腹，腹主动脉取血。3 000～4 000 r/min，离心10 min，取上清，放4℃冰箱，待测。取双侧眼球，其一固定于福尔马林溶液，石蜡包埋，用于视网膜组织病理切片；另一去除前节，显微镜下钝性分离视网膜组织，置于液氮下冷冻储存，用于Westen blot实验及酶联免疫吸附试验（ELISA）。

采用Western blot检测各组大鼠视网膜内IL-6、TNF-α及VEGF的表达差异。使用强细胞裂解液提取各组视网膜总蛋白，以3∶1的比例加入上样缓冲液并充分混匀，100℃水浴10 min蛋白变性。应用双辛丁酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定各组视网膜组织总蛋白，按每孔40 μg蛋白量调整上样，电泳、转膜，牛血清白蛋白（BSA）封闭1 h，添加相应一抗4℃孵育过夜。TBST洗后用相应二抗常温孵育1 h，最后显影定影。采用Image J图像处理软件进行灰度分析，以各目的蛋白与其总蛋白的比值表示蛋白的活性水平，即蛋白相对表达量。

酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大鼠血清IL-6、TNF-α的含量。收集各组大鼠血清，每孔100 μl，设复孔，按照大鼠IL-6、TNF-α的ELISA试剂盒说明书进行操作。用酶联免疫检测仪在波长450 nm下测量光密度D（450 nm），获取大鼠血清中IL-6及TNF-α的含量。

免疫组化法测定NF-κB的表达。取大鼠眼球做冠状切片，石蜡脱蜡至水、修复、3%BSA封闭，添加相应一抗4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液（PBS）洗后用相应二抗常温孵育1 h，DAB显色、复染细胞核、脱水封片。

1.6 统计学方法

SPSS 20.0统计学软件进行统计学分析。计量资

料数据以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用t检验，3组或3组以上组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

Western blot法检测结果显示，与正常组比较，糖尿病组大鼠视网膜IL-6、TNF-α及VEGF蛋白表达明显增高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。与糖尿病组比较，PDC低剂量组、PDC中剂量组及PDC高剂量组大鼠视网膜IL-6、TNF-α及VEGF蛋白表达均有降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。PDC不同剂量组之间两两比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1，图1）

表1 Western blot法检测各组大鼠视网膜IL-6、TNF-α、VEGF蛋白相对表达量比较±s）

表1 Western blot法检测各组大鼠视网膜IL-6、TNF-α、VEGF蛋白相对表达量比较±s）

注：多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。①与正常组比较，P＜0.05；②与糖尿病组比较，P＜0.05IL-6：白细胞介素-6TNF-α：肿瘤坏死因子αVEGF：血管内皮生长因子PDC：铁皮石斛多糖

组别样本量IL-6TNF-αVEGF正常组100.44±0.170.28±0.030.10±0.03糖尿病组101.10±0.20①1.12±0.10①1.33±0.12①PDC低剂量组100.48±0.07②0.47±0.07②0.51±0.08②PDC中剂量组100.64±0.02②0.34±0.08②0.48±0.11②PDC高剂量组100.61±0.12②0.66±0.07②0.60±0.11②F值5.64920.6422.72 P值＜0.05＜0.05＜0.05

图1 各组大鼠视网膜IL-6、TNF-α及VEGF蛋白的活性水平。A.各组大鼠视网膜IL-6、TNF-α及VEGF蛋白表达的Western blot法检测电泳图1.正常组2.糖尿病组3.PDC低剂量组4.PDC中剂量组5.PDC高剂量组。B.各组小鼠视网膜中IL-6、TNF-α及VEGF蛋白的相对表达量比较IL-6：白细胞介素-6 TNF-α：肿瘤坏死因子α VEGF：血管内皮生长因子PDC：铁皮石斛多糖

ELLSA检测结果显示，糖尿病大鼠血清中促炎性细胞因子IL-6、TNF-α含量较正常组有所增加，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。PDC低、中、高各剂量组大鼠血清中促炎性细胞因子IL-6、TNF-α含量较糖尿病组均有所降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。PDC高剂量组之间两两比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

免疫组化切片结果显示，正常大鼠视网膜未见明显NF-κB阳性染色，糖尿病组大鼠视网膜可见神经节细胞层（GCL）及内核层（INL）均可见阳性染色，PDC各处理组阳性染色明显减少（图2）。

3 讨论

表2 ELLSA法检测各组大鼠血清IL-6、TNF-α的含量（±s）

表2 ELLSA法检测各组大鼠血清IL-6、TNF-α的含量（±s）

注：多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。①与正常组比较，P＜0.05；②与糖尿病组比较，P＜0.05IL-6：白细胞介素-6TNF-α：肿瘤坏死因子αPDC：铁皮石斛多糖

组别样本量IL-6TNF-α正常组1023.65±0.833.44±0.06糖尿病组1051.09±2.52①4.33±0.08①PDC低剂量组1027.38±1.23②3.74±0.09②PDC中剂量组1022.17±1.24②3.68±0.08②PDC高剂量组1027.89±1.17②3.70±0.07②F值53.9420.16 P值＜0.05＜0.05

石斛的主要化学成分有多糖类、生物碱类、氨基酸、联苄类、菲类、倍半萜类等，其中多糖含量较高〔4〕。有动物研究表明PDC可以抑制促炎性细胞因子（如IL-1β，IL-10，IL-6，IFN-γ等）、粒细胞-巨噬细胞刺激因子（GM-CSF）和粒细胞-集落刺激因子（GCSF）的活性及表达〔5〕，发挥其抗炎作用。关于PDC

在DR早期的抗炎作用尚无研究。

本研究选取SD大鼠为研究对象，采用STZ腹腔注射诱导糖尿病模型，采用不同方法（Westernblot、ELISA）检测正常组、糖尿病组及各不同剂量处理组大鼠视网膜及血清中促炎性细胞因子表达水平，进而探索PDC在DR中的抗炎机制及作用。结果表明，与正常组比较，糖尿病组大鼠体内促炎性细胞因子水平表达增加；与糖尿病组比较，PDC各剂量处理组大鼠体内促炎性细胞因子表达水平有所下降。说明PDC可以抑制早期DR促炎性细胞因子的表达，进而抑制VEGF的表达上调。此外，采用Western blot检测各组大鼠视网膜内NF-κB蛋白表达水平表明，PDC各处理组可以降低NF-κB蛋白表达，其抗炎作用机制可能与其抑制NF-κB途径的激活有关。本实验结果显示，PDC可以降低糖尿病视网膜病变大鼠体内炎症因子（IL-6、TNF-α）的表达，进而抑制VEGF表达上调。PDC各剂量组间比较，PDC药效并未呈现明显量效关系，提高用量可能并不会增加药物疗效。

NF-κB信号通路在DR的发展过程中起重要作用。在高糖环境下，晚期糖基化终末产物（AGEs）激活，多种因素导致视网膜氧化应激反应，激活NF-κB并启动其下游基因转录，诱导细胞因子（IL-6、TNF-α等）及黏附分子〔6-7〕相互作用、聚集，引发视网膜毛细血管阻塞无灌注、内皮损伤、血管渗漏、新生血管形成等病理过程〔2〕。Shakhov等研究证明，若阻断TNF-α启动子区域的NF-κB结合位点，则不能产生TNF-α，提示NF-κB通路在TNF-α产生中起重要作用〔8〕。高糖环境下，视网膜内高水平的TNF-α、IL-6作用于视网膜微血管，诱导细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）表达增加，促进白细胞与血管内皮细胞的黏附，阻塞血管、毛细血管无灌注，破坏血-视网膜屏障〔9-10〕，最终导致视网膜的损害。此外，IL-6还可通过VEGF基因启动子上特异性DNA序列及5’2非翻译区的特异性元件介导并促进VEGF的表达，进一步促进视网膜新生血管的发生〔11〕。

综上所述，炎症机制在DR早期发生发展中发挥重要作用，严格控制血糖及使用针对炎症的药物有益于DR的治疗〔12〕。根据我国学者近年来对石斛的研究发现，石斛具有抗炎的药理作用，且药物毒副作用较小，可能为糖尿病视网膜病变早期的抗炎治疗提供新的途径。

图2 各组大鼠视网膜核转录因子κB（NF-κB）免疫组织染色像。A.正常组，未见明显阳性染色；B.糖尿病组，显示神经节细胞层（GCL）及内核层（INL）均可见阳性染色（红箭，下同）；C.PDC低剂量组；D.PDC中剂量组、E.PDC高剂量组，GCL层可见少许阳性染色PDC：铁皮石斛多糖

[1]EL-Asrar AM.Role of inflammation in the pathogenesis of diabetic retinopathy[J].Middle East Afr J Ophthalmol，2012，19（1）：70-74.

[2]Stitt AW，Lois N，Medina RJ，et al.Advances in our understanding of diabetic retinopathy[J].Clinical Science，2013，125（1）：1-17.

[3]Cohen T，Nahan D，Cerem LW，et al.Interleuldn-6 induces the expression of vascular endothelial growth factor[J].Biol Chellq，1996，271（2）：736.

[4]凌志扬，房玉良.石斛的化学成分及药理作用[J].中国当代医药，2012，19（5）：13-16.

[5]Shie J，Chen AC.Regioselective synthesis of di-C-glycosylflavones possessing anti-inflammation activities[J].Organic&Biomolecular Chemistry，2010，10（1039）：4551-4462.

[6]Kowluru RA，Koppolu P，Chakrabarti S，et al.Diabetes-induced activation of nuclear transcriptional factor in the retina，and its inhibition by antioxidants[J].Free Radic Res 2003，37（11）：1169-1180.

[7]Lawrence T.The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation [J].Cold Spring Harb Perspect Biol，2009，1（6）：253-266.

[8]Shakhov AN，Collart MA，Vassalli P，et al.KappaB-type enhancers are involved in lipopolysaccharide-mediated transcriptional activation of the tumor necrosis factor-a gene in primary macrophages[J].J Exp Med，1990，171（1）：35-47.

[9]Ferrero E，Zocchi MR，Magni E，et al.Roles of tumor necrosis factor p55 and p75 receptors in TNF-αlpha-induced vascularpermeability [J].Am J Physiol Cell Physiol，2001，281（4）：1173-1179.

[10]Tarr J M，Kaul K，Chopra M，et al.Pathophysiology of Diabetic Retinopathy[J].ISRN Ophthalmology，2013，15：343560.

[11]Cohen T Nahari D，Cerem LW，et al.Interleukin-6 induces the expression of vascular endothelial growth factor[J].J Biol Chem，1996，271（2）：736-741.

[12]金慧昳，刘堃，许迅.炎症、抗炎药物与早期糖尿病视网膜病变的关系[J].中华眼底病杂志，2008，24（2）：312-315.

Effects of polysaccharides of dendrobium candidum on overexpression of inflammatory factors in dia- betic rats with retinopathy

LI Jingwen,LI Guowen,QIN Yu,et al.Bengbu Medical College，Bengbu 233030，China

OBJECTIVE To investigate the influence of polysaccharides of dendrobium candidum（PDC）on overexpression of inflammatory factors in diabetic retinopathy model of rats and its anti-inflammatory effects in early-stage diabetic retinopathy and further to explore the possible mechanism.METHODS The diabetic rat model was established by intraperitoneal injection of streptozotocin.After 6 weeks,they were administrated with DPC in low dosage[100 mg/（kg·d）],middle dosage[200 mg/（kg·d）]and high dosage[300 mg/（kg·d）].After 8 weeks,these animals were anesthetized for specimen collection.Then the protein expression of Interleuldn-6（IL-6）,tumor necrosis factor-α（TNF-α）and vascular endothelial growth factor（VEGF）were detected by Western blot;the expression of IL-6,TNF-α in the serum of rats were determined by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay（ELISA）; the expression of NF-κB p65 in retina was determined by immunohistochemistry.RESULTS Compared with normal group,the protein level of IL-6,TNF-α and VEGF as well as serum IL-6 and TNF-α in diabetic group were increased（P＜0.05）while these indexes all decreased when compared with diabetic group（P＜0.05）.But each marker showed no differences between three PDC groups（P＞0.05）.There was no positive staining of NF-κB in normal group,and the expression of NF-κB in three DPC groups was significantly lower than counterpart in diabetic group whose digit was higher than normal group. CONCLUSIONS PDC could reduce the expression of inflammatory cytokines（IL-6,TNF-α）in diabetic

diabetic retinopathy;polysaccharides of Dendrobium Candidum（PDC）;inflammatory factors; NF-κB

R285.5

A

1002-4379（2016）01-0007-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.01.003

上海中医药大学中西医结合一流学科创新项目基金（2014XK003）

1蚌埠医学院（现在上海市中西医结合医院眼科），安徽省

蚌埠市233030

2上海市中西医结合医院，200082

李春霞，E-mail：cxli_66@163.com

retinopathy rats,and inhibit the VEGF expression.The mechanism might be associated with NF-κB pathway．