封闭抗体阴性的反复自然流产患者采用配偶淋巴细胞主动免疫治疗效果观察

王欣，李培旭

(解放军150医院妇产科，洛阳 471003)



封闭抗体阴性的反复自然流产患者采用配偶淋巴细胞主动免疫治疗效果观察

王欣，李培旭*

(解放军150医院妇产科，洛阳 471003)

目的 观察配偶淋巴细胞主动免疫治疗封闭抗体阴性的反复自然流产的效果。 方法 收集2010年1月至2015年1月于我院行封闭抗体阴性的经治疗后获得首次妊娠的反复自然流产患者97例，依据不同治疗方法分为研究组76例和对照组21例。研究组采用丈夫外周血淋巴细胞主动免疫治疗后观察封闭抗体的变化，对照组采用小剂量免疫抑制剂等治疗，比较两组治疗后首次妊娠的结局。 结果 研究组76例孕妇，妊娠成功51例，妊娠成功率67.11%；对照组21例孕妇，妊娠成功8例，妊娠成功率38.10%。研究组妊娠成功率显著高于对照组妊娠成功率(P<0.05)。研究组76例免疫治疗后复查封闭抗体，27例转阳性孕妇19例妊娠成功，妊娠成功率70.37%，49例仍阴性孕妇32例妊娠成功，妊娠成功率为65.31%；两者比较妊娠成功率差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 免疫治疗可显著提高反复自然流产患者的妊娠成功率，封闭抗体转阳只是其纷繁复杂的机理之一。

反复自然流产； 封闭抗体； 免疫治疗

Methods：The data of 97 patients with recurrent spontaneous abortion & negative anti-paternal lymphocyte antibody who received their first pregnancy in our hospital from Jan.2010 to Jan.2015 were collected.The patients were divided to two groups：the patients in the study group were treated with paternal lymphocyte(n=76)，and the patients in control group were treated with small doses of immunosuppressants(n=21).The first pregnant outcomes were compared between the two groups.

Results：The pregnancy rate(67.11% vs.38.10%)of the study group is significantly higher than that of the control group(P<0.05).In the studying group，the pregnancy rate(70.37%)in 27 patients whose APLA turned positive was higher than that(65.31%)in 49 patients whose APLA was still negative after immunotherapy(P>0.05).

Conclusions：The pregnancy rate is significantly increased after immunotherapy with paternal lymphocyte；but the results are not always consistent with the changes in APLA.

(JReprodMed2016，25(11)：998-1001)

自然流产是指妊娠20周以前或者胎儿体重小于450克，或在获得有生机儿之前的自然流产或胚胎宫内停止发育；反复自然流产(RSA)是指连续2次及以上发生自然流产[1]。收集我院近5年因反复自然流产就诊、经临床检查排除生殖器官器质性病变、染色体异常、黄体功能不足、动静血栓前状态等，封闭抗体(APLA)检测结果为阴性、经过小剂量免疫抑制剂治疗或者丈夫外周血淋巴细胞免疫治疗(immunotherapy)后获得首次妊娠的患者97例，根据治疗方法不同分为两组：研究组(76例)采用配偶淋巴细胞主动免疫治疗；对照组(21例)采用小剂量免疫抑制剂等治疗，结果报告如下。本研究通过分析两组患者治疗后妊娠结局及封闭抗体转阳情况，旨在探寻新的临床RSA患者进行淋巴免疫治疗后疗效评价和妊娠预后判断的参考指标。

材料与方法

一、临床资料

收集我院2010年1月至2015年1月因两次及以上自然流产就诊的重复流产患者97例，经临床检查排除生殖器官器质性病变、染色体异常、黄体功能不足、动静血栓前状态等，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测封闭抗体为阴性经治疗后获得首次宫内妊娠，年龄20～32岁、平均(25.60±5.95)岁，流产2～6次、平均(3.75±1.88)次。临床详细询问患者每次流产的情况：包括孕周、出血、腹痛、尿及血HCG、彩色多普勒超声检查等，以确认妊娠和流产的诊断成立，并且无淋巴细胞免疫治疗史及输血史。常规检查：①男方精液正常且无淋球菌、支原体、衣原体感染；②夫妻双方染色体正常且Rh血型阳性、双方血常规和血红蛋白正常、双方艾滋病和梅毒筛查阴性；③女方常规妇科及彩色多普勒超声检查或子宫输卵管造影检查排除子宫及宫颈畸形，宫颈管阴道内无滴虫、霉菌、淋球菌、支原体、衣原体感染，自身免疫性抗体抗心磷脂抗体、抗子宫内膜抗体、抗β2-糖蛋白1抗体均阴性，内分泌激素正常，凝血四项及血脂四项正常，不孕及优生抗体全套筛查阴性。

二、实验方法

对照组21例，皆因丈夫乙型或丙型肝炎病毒感染或携带，不宜采用其血液分离淋巴细胞给妻子做免疫治疗的患者，从试孕前6周开始每日口服强的松5 mg(浙江仙琚制药)+肠溶阿司匹林25 mg(石家庄欧意药业)+维生素E 100 mg(浙江医药)，直至妊娠满36周止，每一月查血小板计数、凝血功能及纤溶指标；研究组76例，签署淋巴免疫治疗知情同意书，于试孕前6周开始，取丈夫肘静脉空腹血20 ml，加入适量肝素钠溶液(2 ml，12 500 U，上海第一生化药业)防止血液凝固，将血液用生理盐水按1∶1的比例稀释；在4根无菌离心试管底部加入3 ml淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品)，再将稀释均匀的血液平均加入到这4根离心管中使其两两平衡，并保持血液和淋巴细胞分离液形成的界面清晰；将离心管平衡放入离心机内以2 000 r/min的速度离心20 min，集中4根离心管中的淋巴细胞到清洁无菌的离心管内，加入10 ml生理盐水以2 000 r/min的速度离心10 min，去上清液；反复生理盐水洗涤淋巴细胞3次，调整悬液淋巴细胞浓度到2x108个/ml；于妻子前臂内侧行皮内注射，每个点约0.2 ml，共6个点。间隔两周重复1次共3次；第3次治疗后两周酶联免疫吸附试验复查封闭抗体，同时安排试孕，待确定怀孕后重复上述免疫治疗1次。

三、观察指标

观察淋巴细胞免疫治疗后APLA的表达情况、妊娠结局；妊娠成功评定标准：妊娠超过28周且B超提示胎儿宫内发育良好，包括早产及妊娠足月分娩。

APLA的检测：每例研究对象抽取外周静脉血3 ml，离心析出血清，采用酶联免疫吸附试验(ELISA，莱姆德，美国)进行血清APLA的检测，严格按照试剂盒操作说明进行操作。

四、统计学方法

结 果

一、对照组与研究组一般情况比较

比较两组患者年龄、流产次数，差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。对照组21例患者服药期间无不良反应，研究组有3例患者治疗期间注射部位偶感瘙痒。

二、两组妊娠成功率比较

对照组和研究组妊娠成功率比较：对照组21例孕妇，妊娠不成功13例，10例再次发生自然流产，3例胚胎停止发育；妊娠成功8例，其中7例妊娠至足月顺利分娩存活新生儿，1例合并妊娠高血压疾病重度子痫，孕36周行剖宫产术新生儿存活，妊娠成功率为38.10%。研究组76例孕妇，妊娠不成功25例，15例再次自然流产，10例胚胎停止发育；妊娠成功51例，其中50例妊娠至足月顺利分娩存活新生儿(其中1例胎儿宫内生长受限)，1例早产，妊娠成功率67.11%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示免疫治疗显著提高了反复自然流产患者的妊娠成功率(表2)。

表1 两组一般资料比较(x-±s)

注：与对照组比较，P>0.05

表2 两组妊娠成功率比较[n(%)]

注：与对照组比较，P<0.05

三、研究组免疫治疗后封闭抗体的变化

研究组76例免疫治疗后复查封闭抗体，27例转阳性孕妇中5例再次自然流产，3例胚胎停止发育，19例妊娠足月顺利分娩存活新生儿，妊娠成功率70.37%，49例仍阴性孕妇中10例再次自然流产，7例胚胎停止发育，31例妊娠足月顺利分娩存活新生儿(其中1例胎儿宫内生长受限)，1例早产，妊娠成功率为65.31%；两者比较无统计学差异(P> 0.05)。提示免疫治疗能显著提高反复自然流产患者的妊娠成功率，但并不一定能使封闭抗体转阳。

讨 论

反复自然流产的病因很多，目前已经明确的病因包括：染色体异常、生殖系统结构异常、黄体功能不足、抗磷脂抗体综合征、动静脉血栓前状态、甲状腺功能低下及感染等因素，但仍约有50%～70%的患者病因不明，称为原因不明性复发性流产(URSA)[2]，病因可能主要与免疫因素造成封闭抗体缺乏有关[3-4]。人类白细胞抗原(HLA)、滋养层及淋巴细胞交叉反应抗原(TLX)等对母体免疫系统发生刺激所产生的一类IgG抗体称为封闭抗体[5]。Taylor等[6]首次报导淋巴细胞主动免疫治疗复发性流产并获得了81.5%以上的活婴出生率。淋巴细胞主动免疫治疗复发性流产的疗效近年来已得到肯定，国内外文献报道其有效率可达70%～90%[7]，杨章莉等[8]报道淋巴细胞主动免疫联合地屈孕酮治疗封闭抗体阴性所致复发性流产患者妊娠成功率高(83.3%)，陈建玲[9]通过对380例淋巴细胞主动免疫疗法治疗不明原因的复发性流产疗效观察，认为该方案治疗不明原因的复发性流产有效率为89.7%。本研究结果研究组76例孕妇，妊娠成功51例，妊娠成功率67.11%；对照组21例孕妇，妊娠成功8例，妊娠成功率38.10%；两者比较，研究组妊娠成功率显著高于对照组妊娠成功率(P<0.05)；且研究组复查封闭抗体，27例转阳性孕妇获得19例妊娠成功，妊娠成功率70.37%，与文献报道一致，说明淋巴主动免疫治疗确能提高封闭抗体阴性所致复发性流产患者的妊娠成功率。本研究把孕前经3次淋巴免疫治疗APLA仍阴性的反复自然流产患者仍作为一部分观察对象，不管淋巴免疫治疗后APLA为阳性或阴性，这是本研究与其他同类研究选取淋巴免疫治疗后复查APLA阳性的有复发流产病史患者为研究对象的不同之处。

淋巴免疫治疗(LIT)治疗机制：1、主要是将外源体淋巴细胞注射到患者体内，从而对患者的免疫系统产生刺激，诱导产生APLA，当其再次妊娠时，APLA抗体就能识别胚胎上来自配偶的抗原，并与之结合，继而产生封闭作用，可使胚胎得到保护并生长；2、可改变不明原因复发性流产患者外周血T细胞的功能，降低Th1/Th2比值，使患者处于以Th2为主的免疫状态而有利于成功妊娠[10]。Th1和Th2细胞是CD4+T细胞的两个亚群，Th1细胞的作用为分泌TNF-α，IFN-γ和IL-2等促炎因子参与移植排斥反应，而TH2细胞分泌的IL-10和IL-13等抑炎因子可以诱导机体对移植物的耐受，正常妊娠中Th1细胞比例降低而Th2细胞比例上升。3、妊娠中外周血NK细胞的细胞毒性调节就是妊娠成功与否的关键[11-12]，LIT能降低NK细胞活性，保护细胞滋养细胞免受NK细胞损伤。目前对LIT机制的探讨主要集中在“封闭抗体”、Th1/Th2平衡、NK细胞活性等方面，研究认为LIT治疗能够纠正母胎界面紊乱的免疫反应[13]，维持正常妊娠。

本研究结果显示研究组76例免疫治疗后复查封闭抗体，27例转阳性孕妇获得19例妊娠成功，妊娠成功率70.37%，49例未转阳性孕妇获得32例妊娠成功，妊娠成功率为65.31%；两者比较无统计学差异；提示淋巴免疫治疗能显著提高复发流产患者的妊娠成功率，但并不一定能使封闭抗体转阳。由此可见淋巴免疫治疗提高妊娠成功率的机理应该极其复杂，使能够被检测的封闭抗体转阳只是其机理之一；这也是不明原因复发性流产的复杂性所决定的。目前临床上对于RSA的诊断和治疗监测主要是通过ELISA法检测母体血液中是否含有足量的抗混合HLA抗体[14-17]，由于封闭抗体的复杂性和多样性，目前还无法对各种封闭抗体进行全面、准确、快速的定量检测，因此封闭抗体的检测具有难把握性，所以也就无法全面反映免疫治疗的效果。妊娠是复杂的，不明原因复发性流产是更复杂的，不是单纯封闭抗体缺乏都能解释的，是否有其他的指标可以明确评价淋巴免疫治疗后效果，有待于我们进一步去探索。

综上所述，免疫治疗可显著提高反复流产患者的妊娠成功率，封闭抗体转阳只是其纷繁复杂的机理之一。

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[编辑：王慧萍]

Effect of immunotherapy with paternal lymphocyte for patients with recurrent spontaneous abortion & negative anti-paternal lymphocyte antibody

WANG Xin，LI Pei-xu*

DepartmentofGynecology，The150thHospitalofPLA，Luoyang471003

Objective：To observe the effect of immunotherapy with paternal lymphocyte for the patients with recurrent spontaneous abortion & negative anti-paternal lymphocyte antibody(APLA).

Recurrent spontaneous abortion； Anti-paternal lymphocyte antibody； Immunotherapy

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.11.009

2016-03-01；

2016-04-20

王欣，女，河南南阳人，学士，主治医师，妇产科专业(*