淋巴细胞免疫治疗对反复妊娠流产患者封闭抗体表达的影响及其临床意义

陈伟才　李琳　何金勇　孔莹

【摘要】 目的：探究淋巴细胞免疫治疗对反复性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）患者封闭抗体（blocking anti-bodies，BA）的表达影响及其临床意义。方法：选取2015年1月-2016年1月本院确诊为RSA患者269例，均行淋巴细胞免疫疗法。检测患者治疗前后外周血BA表达、免疫球蛋白浓度、淋巴细胞亚群数量及相关比值，患者治疗后均随访1年，记录随访期间患者妊娠情况。结果：治疗前BA阳性24例（8.92%），低于治疗后的225例（83.64%），比较差异有统计学意义

（字2=324.51，P=0.000）；治疗后IgA、IgM、IgG水平均低于治疗前（P<0.05）；且治疗后，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均低于治疗前，CD8+高于治疗前，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；BA阳性孕妇妊娠成功率为92.18%（165/179），明显高于BA阴性孕妇的60.00%（3/5），比较差异有统计学意义（字2=6.344，P=0.012）。结论：淋巴细胞免疫治疗RSA有助于提高患者BA表达，调节患者免疫水平并增加妊娠成功率。

【关键词】 淋巴细胞免疫疗法； 反复性流产； 封闭抗体； 淋巴细胞亚群

【Abstract】 Objective：To explore the effect of lymphocyte immunotherapy on the expression of blocking anti-bodies（BA） in patients with recurrent spontaneous abortion（RSA） and its clinical significance.Method：A total of 269 patients with RSA diagnosed in our hospital from January 2015 to January 2016 were selected，they were treated with lymphocyte immunotherapy.The expression of BA，the concentration of immunoglobulin，the number of lymphocyte subsets and the relative ratio were measured before and after treatment，they were followed up for 1 year after treatment，and the pregnancy was recorded during the follow-up period.Result：Before treatment，BA positive was 24 cases（8.92%），lower than 225 cases（83.64%） of after treatment，the difference was statistically significant（字2=324.51，P=0.000）.After treatment，the levels of IgA，IgM and IgG were all lower than those of before treatment（P<0.05）.After treatment，CD3+，CD4+ and CD4+/CD8+ were all lower than those of before treatment，CD8+ was higher than that of before treatment，the differences were statistically significant（P<0.05）.The pregnancy rate of BA positive pregnant women was 92.18%（165/179），which was significantly higher than 60.00%（3/5） in BA negative pregnant women，the difference was statistically significant（字2=6.344，P=0.012）.Conclusion：Lymphocyte immunotherapy in treatment of RSA can help improve BA expression，regulate immune function and increase pregnancy success rate.

【Key words】 Lymphocyte immunotherapy； Recurrent spontaneous abortion； Blocking anti-bodies； Lymphocyte subsets

First-authors address：Shunde Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Foshan 528333，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.21.016

反復性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指同一妇女连续发生3次及以上的自然流产，其发病率在育龄期女性中为1%～3%[1]，RSA发病与患者内分泌、生殖道异常、遗传因素等多个方面均有关联，但具体发病病因尚未阐明[2]。妊娠过程中，胚胎作为一种同种异体移植物被母体识别，正常情况下母体会产生封闭抗体（blocking anti-bodies，BA）以降低自身免疫系统对胚胎的攻击[3]，但研究发现，40%～65%的患者存在不同程度的BA分泌缺陷导致发病[4]。而淋巴免疫治疗是通过将患者丈夫或第三健康人的外周血中淋巴细胞注入患者皮下，进而产生类似于BA的IgG以达到保护胚胎，持续妊娠的作用[5]，但其疗效仍存在很大的争议，现笔者通过分析行淋巴细胞免疫治疗的反复流产患者治疗前后BA产生情况，以及患者体内免疫因子水平变化，以期为淋巴细胞免疫治疗的推广提供数据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月-2016年1月本院确诊为RSA患者269例。（1）纳入标准：①均经历3次或3次以上不明原因流产；②夫妻双方染色体核型分析均正常；③血型和抗体为母胎ABO不相容；④丈夫精液常规检查正常，抗精子抗体阴性；⑤患者凝血功能正常；⑥TORCH 4项（风疹病毒、单纯疱疹病毒、弓形体、巨细胞病毒）阴性；

⑦抗心磷脂抗体、抗子宫内膜抗体、抗卵巢抗体、抗绒毛膜促性腺激素抗体、抗透明带抗体、抗滋养细胞层抗体、抗核抗体、抗双链DNA抗体均呈阴性。（2）排除标准：近亲婚配；有吸烟、酗酒、吸毒等不良习惯；存在生殖器异常或病变。269例患者年龄21～37岁，平均（27.89±3.47）岁；孕次3～5次，平均（4.10±0.85）次。患者均行淋巴细胞免疫疗法，患者均签署知情同意书，本研究经本院伦理委员会批准同意。

1.2 淋巴细胞免疫治疗方法 首选患者配偶进行淋巴细胞主动免疫测试，如果存在梅毒螺旋体、艾滋病及肝炎病毒等疾病则采用健康第三者的淋巴细胞进行治疗。抽取外周血30 mL，分离淋巴细胞制成悬浮液，抽取0.3 mL淋巴细胞悬液注射于患者前臂近腋窝分5～8点进行皮内注射，皮丘直径0.5 cm左右，每2～4周1次，左右臂交替，4次为一疗程。疗程结束后复查BA，若转为阳性则指导受孕；若BA阴性则进行第2个疗程的治疗，以此类推。若

3个疗程后BA仍阴性者剔除出本研究。对BA转阳者立即指导受孕，并每2～3个月进行1次维持治疗，妊娠后每1～2个月进行1次治疗，直至妊娠12周或超声显示胎盘形成良好。治疗后均随访1年，记录随访期间患者妊娠情况。

1.3 观察指标 （1）BA：每个治疗疗程前后，抽取患者排卵期间抽取晨起空腹静脉血5 mL，高速离心后取上清液，采用ELISA法进行检测，具体操作步骤按照所购买的试剂盒进行操作（BAELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司）。（2）IgA、IgM、IgG表达水平：治疗前后，抽取患者排卵期间抽取晨起空腹静脉血5 mL，高速离心后取上清液，采用放射比浊法检测IgA、IgM、IgG表达水平，操作步骤严格按照说明书进行操作（IgA、IgG和IgM试剂及校准品均购自美国Beckman公司）。（3）淋巴细胞亚群水平：治疗前后，抽取患者排卵期间抽取晨起空腹静脉血5 mL，采用流式细胞仪（CytoFLEX流式细胞仪购自美国Beckman有限公司）进行分析，计算其中CD4+、CD3+、CD8+淋巴细胞相对数目以及CD4+/CD8+。

1.4 统计学处理 使用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者治疗前后BA阳性表达情况比较 治疗前BA阳性24例（8.92%），低于治疗后的225例（83.64%），比较差异有统计学意义（字2=324.51，P=0.000）。其中淋巴细胞免疫治疗1个疗程时，BA阳性率43.49%（117/269）；共有152例患者进行淋巴细胞免疫治疗2个疗程，BA阳性率为44.74%（68/152）；共84例进入淋巴细胞免疫治疗3个疗程时，BA阳性率为47.62%（40/84）。

2.2 患者治疗前后IgA、IgM、IgG水平比较 淋巴细胞免疫治疗后IgA、IgM、IgG水平均低于治疗前（P<0.05），见表1。

2.3 患者治疗前后淋巴细胞亚群表达比较 治疗后，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均低于治疗前，CD8+高于治疗前，比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.4 患者治疗后随访1年的情况 269例患者中妊娠184例，妊娠率为68.40%，其中BA阳性妊娠179例，BA阴性妊娠5例。BA阳性225例中，

179例妊娠，妊娠率为79.56%，其中154例已足月分娩，11例已孕12周以上，14例自然流產，自然流产率为7.82%；BA阴性44例，5例妊娠，妊娠率为11.36%，其中2例已足月分娩，1例已孕12周以上，2例自然流产，自然流产率为40.00%。BA阳性孕妇妊娠成功率为92.18%（165/179），明显高于BA阴性孕妇的60.00%（3/5），比较差异有统计学意义（字2=6.344，P=0.012）。

3 讨论

自然流产占妊娠总数的15%左右，其中3次或3次以上自然流产即RSA，其发病率为1%～3%[6]，但RSA发病机制复杂，除了遗传、解剖、内分泌、感染等因素后，仍有40%～80%的病例发病原因不明[7-8]。目前临床认为，母体免疫系统将胚胎视为外来物进行攻击导致的流产为主要因素[9]，BA是由机体白细胞抗原（HLA）、滋养层及淋巴细胞交叉反应抗原等刺激母体免疫系统所产生的一类抗体[10]，胚胎携带来源于父系的多态基因，作为半抗原可激活母体免疫应答[11]，但在正常情况下，母体的免疫系统对于胎儿的同种免疫反应受到了抑制，多种免疫因素通过有机协调达到母胎间的免疫平衡，避免胚胎受到免疫排斥[12-13]，使得妊娠得以进行。一旦这种平衡状态被打破，胚胎极易受到母体免疫攻击而发生流产[14]。

而淋巴细胞免疫治疗是采用配偶或无关个体的淋巴细胞在患者前臂等处进行皮下注射，导母体产生同种免疫反应，并产生相应的BA[15-16]，以及微淋巴细胞毒抗体，降低母体免疫系统对胚胎的免疫排斥反应[17]，使得患者妊娠能够继续，本研究结果显示，治疗前BA阳性24例（8.92%），低于治疗后的225例（83.64%），比较差异有统计学意义（P<0.05）。提示该方法对于大部分反复流产的患者可有效诱导BA增加，但仍有少数患者无法产生BA，其中具体原因仍不清楚。其中淋巴细胞免疫治疗每个疗程出现BA阳性的概率在40%～50%，这与患者个体实际情况有关。

此外研究结果显示，治疗后IgA、IgM、IgG水平均低于治疗前（P<0.05）；且治疗后，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均低于治疗前，CD8+高于治疗前，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。说明淋巴细胞免疫治疗对患者的免疫系统出现了一定的调整，研究发现女性子宫内膜中T淋巴细胞主要以CD8+为主[18]，CD8+细胞可分化为Tc2细胞分泌Th2有助于妊娠过程[19]，并抑制B细胞介导的体液免疫与抑制CD4+细胞介导的超敏反应[20]，淋巴治疗后CD8+水平上升，有助于患者提高妊娠成功率。IgA、IgM、IgG水平的降低，说明了免疫淋巴细胞治疗除了提高BA抗体数目，还可轻微抑制患者免疫系统，降低免疫系统对胚胎的杀伤风险。

随访发现，269例患者中妊娠184例，妊娠率为68.40%，其中BA阳性妊娠179例，BA阴性妊娠5例；BA阳性孕妇妊娠成功率为92.18%（165/179），明显高于BA阴性孕妇的60.00%（3/5），比较差异有统计学意义（P<0.05）。说明免疫淋巴细胞治疗可有效提高患者妊娠成功率。

综上所述，淋巴细胞免疫治疗RSA有助于提高患者BA表达，调节患者免疫水平并增加妊娠成功率。

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（收稿日期：2018-04-24） （本文编辑：董悦）