外周血淋巴细胞亚群分布对同种免疫型复发性流产病因及淋巴细胞免疫治疗效果的评估价值

陈丽莉 陈建安 黎丽芬 朱学海 林偲思

【摘要】 目的：探討外周血淋巴细胞亚群对同种免疫型复发性流产病因及淋巴细胞主动免疫治疗（LIT）效果的评估价值。方法：选取2015年4月-2018年4月本院收治的自愿接受LIT的同种免疫型复发性流产患者85例作为观察组，以同期正常妊娠者78例作为对照组，比较两组外周血淋巴细胞亚群分布差异。对接受LIT的患者，比较一疗程组与两疗程组患者外周血淋巴细胞亚群分布差异。结果：观察组与对照组的外周血CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、Th/Ts、CD19+B细胞、CD3-CD56+NK细胞比例比较，差异均无统计学意义（P>0.05）;一疗程组治疗前CD4+CD25+T细胞比例显著高于两疗程组，差异有统计学意义（P<0.05）;一疗程组与两疗程组治疗前的CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD19+B细胞、CD3-CD56+NK细胞、CD3-CD56+CD16-NK细胞比例比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：外周血CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、Th/Ts、CD19+B细胞及CD3-CD56+NK细胞比例不能对同种免疫型复发性流产进行病因评估，外周血淋巴细胞亚群是否能评估同种免疫型复发性流产的发生仍需多组数据论证。患者外周血CD4+CD25+T细胞可在淋巴细胞免疫治疗前预评估封闭抗体转为阳性情况，为评估治疗效果提供参考。

【关键词】 同种免疫型复发性流产 淋巴细胞亚群 淋巴细胞免疫治疗 封闭抗体

[Abstract] Objective： To evaluate the value of peripheral blood lymphocyte subsets on the etiology of recurrent alloimmune abortion and the efficacy of lymphocyte immunotherapy treatment （LIT）. Method： A total of 85 cases of voluntary LIT recurrent alloimmune abortion patients admitted to our hospital from April 2015 to April 2018 were selected as the observation group， 78 cases of normal pregnancy during the same period were taken as the control group. The distribution of peripheral blood lymphocyte subsets was compared between the two groups. For patients received LIT， the distribution of peripheral blood lymphocyte subsets between the one-course group and two-course group was compared. Result： The ratio of CD3+T cells， CD3+CD4+T cells， CD3+CD8+T cells， Th/Ts， CD19+B cells and CD3-CD56+NK cells in peripheral blood of the observation group and the control group were compared， the differences were not statistically significant （P>0.05）. The proportion of CD4+CD25+T cells in the one-course group before treatment was significantly higher than that in the two-course group， the difference was statistically significant （P<0.05）. The ratio of CD3+T cells， CD3+CD4+T cells， CD3+CD8+T cells， CD19+B cells， CD3-CD56+NK cells and CD3-CD56+CD16-NK cells in the one-course group and two-course group were compared， there were no significant differences （P>0.05）. Conclusion： The ratio of CD3+CD4+T cells， CD3+CD8+T cells， Th/Ts， CD19+B cells and CD3-CD56+NK cells in peripheral blood cannot be used to evaluate the etiology of recurrent alloimmune abortion， and multiple sets of data are still needed to evaluate whether the lymphocyte subsets in peripheral blood can evaluate the occurrence of recurrent alloimmune abortion. CD4+CD25+T cells in peripheral blood of patients can be used to evaluate the positive status of blocking antibody before lymphocyte immunotherapy， providing a reference for the evaluation of treatment effect.

复发性自然流产（recurrent spontaneous abortion， RSA）是指与同一性伴侣连续发生3次及以上妊娠28周前的自然流产，其发生率为1%～4%[1-3]。在RSA的众多病因中，同种免疫异常所占比例最高[4]。同种免疫型复发性流产又被称为不明原因复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion， URSA），即排除遗传、解剖、内分泌、感染、自身免疫、血栓前状态、孕妇的全身性疾病等病因的RSA。以往许多研究集中在URSA发病机制与淋巴细胞的免疫调节关系上，但对于外周血淋巴细胞是否能反映母胎界面免疫状态的结论多不一致。另外，国内研究认为淋巴细胞免疫治疗（lymphocyte immunotherapy treatment， LIT）可明显改善URSA患者的妊娠结局，但目前对LIT的治疗剂量和方案没有统一标准[5-6]，对于不同患者的治疗方案调整亦没有理论依据支持，因此本文拟评估本院URSA患者外周血淋巴细胞亚群对URSA发生的价值，进而评估LIT前URSA患者外周血淋巴细胞亚群对LIT疗效的预评估作用。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年4月-2018年4月本院收治的自愿接受LIT的同种免疫型复发性流产患者85例以及同期正常妊娠者78例为研究对象。纳入标准：（1）连续3次以上自然流产且封闭抗体阴性;（2）通过分泌物检查排除生殖器感染;（3）通过超声或宫腔镜排除生殖器异常及其他病变;（4）抗子宫内膜抗体、抗卵巢抗体、抗绒毛膜促性腺激素抗体、抗精子抗体、抗心磷脂抗体、抗核抗体、抗双链DNA抗体均为阴性;（5）凝血功能正常;（6）男方精液常规正常、抗精子抗体、支原体、衣原体、乙肝病毒、HIV、梅毒抗体等均为阴性;（7）夫妻TORCH-IgM病毒抗体阴性;（8）夫妻染色体核型分析正常且非近親结婚;（9）研究对象以往均未接受过LIT。排除标准：（1）通过辅助生殖技术受孕的患者;（2）年龄大于43岁的患者。以85例患者为观察组，以78例正常妊娠者为对照组。夫妻双方均对LIT充分了解，研究对象均签署知情同意书，研究已经医院伦理学委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 检测及治疗方法 （1）封闭抗体检测：采集患者肘静脉血2 mL，采用酶联免疫吸附试验进行外周血封闭抗体检测，每次检测均设阴性、阳性和空白对照，检测步骤及结果判读严格按照试剂盒说明书进行。（2）外周血淋巴细胞亚群检测：采集患者肘静脉血2 mL EDTA-K2抗凝，分别取抗凝全血50 μL加入4个流式细胞计数试管中，分别往第1管加入CD45-FITC、CD3-PC5、CD8-ECD、CD4-RD1抗体各5 μL，第2管加入CD45-FITC、CD19-ECD、CD56-RD1抗体各5 μL，第3管加入CD45-Cy7、CD4-PE、CD25-FITC抗体各5 μL，第4管加入CD45-FITC、CD3-PC5、CD16-PE、CD56-RD1抗体各5 μL，避光反应20 min后，加入红细胞裂解液500 μL，避光反应20 min后加入PBS缓冲液，用流式细胞仪分析计算淋巴细胞亚群比例。（3）淋巴细胞分离方法：患者丈夫无肝炎、梅毒、艾滋病及TORCH病毒感染方可作为LIT的细胞供给者。采集淋巴细胞供给者外周血30 mL（肝素钠抗凝），缓缓加入到20 mL淋巴细胞分离液中，2 000 r/min离心30 min，收集中间层细胞放入含6 mL生理盐水的试管中混匀，2 000 r/min离心5 min，弃去上清后用生理盐水反复洗涤沉淀物2次，最后配制成浓度为（2～4）×107/mL的淋巴细胞悬液。（4）LIT方法：取浓度为（2～4）×107/mL的淋巴细胞悬液在患者手臂内侧进行8～10个点皮内注射。每3周1次，4次为1个疗程，治疗1个疗程后复查封闭抗体，封闭抗体转为阳性即指导受孕，受孕后每2周接受LIT 1次，直至妊娠10周后调整治疗方案为每3周接受LIT 1次，直到妊娠16周治疗结束。治疗1疗程后封闭抗体仍未转为阳性者，继续下一疗程治疗，直至封闭抗体转为阳性后再鼓励受孕。经过两个疗程治疗后封闭抗体仍未转为阳性者，不列入本次研究范畴。

1.2.2 仪器与试剂 封闭抗体检测试剂盒（酶联免疫法）为北京索奥生生物科技有限公司提供，淋巴细胞分离液为美德太平洋（天津）生物科技股份有限公司提供，CD3-PC5、CD8-ECD、CD4-RD1、CD45-FITC、CD19-ECD、CD56-RD1、CD3-ECD、CD4-PE、CD25-FITC、CD56-PE、CD16-FITC、CD45-Cy7等荧光抗体试剂为美国贝克曼-库尔特公司提供，FC500 MCL流式细胞仪为美国贝克曼-库尔特公司生产，BC5380全自动血球分析仪为深圳迈瑞公司生产，飞鸽牌Anke TDL-5-A型水平离心机，广州阳普EDTA-K2抗凝管、分离胶-促凝剂促凝管，肝素钠注射液（生产厂家：上海第一生化药业有限公司，批准文号：国药准字H31022051，规格：2 mL︰12 500单位）。

1.3 观察指标及判定标准 比较两组外周血淋巴细胞亚群;比较LIT一疗程组与两疗程组治疗前外周血淋巴细胞亚群比例。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料符合正态分布用（x±s）表示，组间比较采用t检验;不符合正态分布以[M（P25，P75）]描述，组间比较采用Wilcoxon秩和检验;计数资料用率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 观察组年龄24～42岁，平均（30.8±4.6）岁;对照组年龄22～40岁，平均（29.5±4.2）岁。两组年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 两组外周血淋巴细胞亚群比较 两组外周血CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、Th/Ts、CD19+B细胞、CD3-CD56+NK细胞比例比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.3 一疗程组与两疗程组治疗前外周血淋巴细胞亚群比例比较 85例接受LIT的URSA患者中，经一疗程治疗后封闭抗体转为阳性者占75.3%（64/85），经两疗程治疗后封闭抗体转为阳性者占23.5%（20/85），1例经两疗程治疗后封闭抗体仍为阴性。一疗程组年龄25～42岁，平均（31.3±4.9）岁，流产3～6次，平均（4.2±0.8）次;两疗程组年龄24～41岁，平均（30.7±4.5）岁，流产3～6次，平均（3.9±0.7）次。两组患者年龄、流产次数比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。一疗程组治疗前CD4+CD25+T细胞比例显著高于两疗程组，差异有统计学意义（P<0.05）;一疗程组与两疗程组的CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD19+B细胞、CD3-CD56+NK细胞、CD3-CD56+CD16-NK细胞比例比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

3 讨论

同种免疫耐受异常被认为是URSA发生的主要原因，但造成同种免疫耐受异常的因素很多，具体病理机制尚未明确[7-9]。近年来很多研究表明同种免疫耐受机制与T淋巴细胞、自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞等多种职能细胞的表达及调节功能等因素相关，在妊娠后，胚胎得以在母体内存活主要依靠母体与胚胎之间形成的免疫耐受，如果两者之间的免疫耐受失衡，母体对胚胎就会产生排斥反应，最终导致流产[10]。目前对母体免疫职能细胞的研究主要分两部分，一部分为研究母体外周血淋巴细胞，另一部分为研究母胎界面的淋巴细胞。其中对母体外周血淋巴细胞的研究结论争议较大，有研究显示外周血T淋巴细胞数量及活性与URSA无相关性，NK淋巴细胞数量及活性与URSA明显相关[11-12]，另有研究则认为URSA患者外周血T淋巴细胞、NK淋巴细胞数量及活性均显著增高[13]。另一方面，罗智华等[14]对母胎界面的淋巴细胞进行研究，认为子宫内膜的淋巴细胞与外周血相应的淋巴细胞之间无显著相关性，子宫内膜淋巴细胞亚群比例变化可能才是母胎交互作用的重要反映。本文通过对比URSA患者与正常妊娠者的外周血淋巴细胞亚群比例，结果显示两组外周血CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、Th/Ts、CD19+B细胞、CD3-CD56+NK细胞比例比较，差异均无统计学意义（P>0.05），与上述研究结论较为一致，推测外周血淋巴细胞亚群比例并不能反映母胎界面的免疫状况。这里值得注意的是，虽然本研究显示URSA患者外周血淋巴细胞亚群比例与正常妊娠人群没有显著差异，但不排除两者的外周血淋巴细胞活性存在差异，因此外周血淋巴细胞能否反映同种免疫耐受的机制尚需多组数据论证。

封闭抗体（blocking antibody， BA）是针对胚胎人类白细胞Ⅱ类抗原（HLA-Ⅱ）和滋养淋巴细胞交叉抗原（TLX）而产生的，可通过与胎儿胎盘滋养层抗原结合或与母体淋巴细胞结合而防止胚胎父系抗原被母体免疫系统识别和杀伤，阻止胚胎滋养细胞遭受免疫攻击[15]。BA缺乏是URSA发生的重要原因之一[16]，目前对于BA缺乏的URSA患者，较多采用丈夫或第三方外周血淋巴细胞进行免疫治疗，治疗后当BA转为阳性时即指导患者受孕[17-18]。本次研究发现，部分患者经一个疗程治疗后即可使封闭抗体转为阳性，而部分患者则需要两个疗程才能使封闭抗体转为阳性，但对于不同的患者，目前均采用相同的治疗剂量和治疗方案，如能筛选出对免疫治疗疗效起到预评估作用的指标，则可为治疗剂量或方案的调整提供参考。本次研究结果显示，一疗程组治疗前CD4+CD25+T细胞比例显著高于两疗程组，差异有统计学意义（P<0.05）;一疗程组与两疗程组的CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T細胞、CD19+B细胞、CD3-CD56+NK细胞、CD3-CD56+CD16-NK细胞比例比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。CD4+CD25+T细胞是近年发现的CD4+T淋巴细胞的子集，其通过细胞间抑制或分泌抑制性细胞因子发挥作用，是一种具有免疫抑制作用的细胞群[19]。CD4+CD25+T细胞除了可增强母体对胚胎的免疫耐受，保护胚胎不受同种异体免疫攻击外[20]，本文结果还提示治疗前外周血CD4+CD25+T细胞可评估患者免疫治疗后BA转为阳性情况，为预评估免疫治疗疗效及免疫治疗剂量或方案调整提供参考。

URSA病因复杂，本文暂未发现外周血CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、Th/Ts、CD19+B细胞及CD3-CD56+NK细胞比例可对URSA进行病因评估，外周血淋巴细胞亚群是否能评估URSA的发生仍需多组数据论证。而对于URSA患者，接受免疫治疗前外周血CD4+CD25+T细胞比例可评估免疫治疗后BA转为阳性的情况，CD4+CD25+T细胞比例低的患者，其BA转为阳性的治疗疗程长，因此外周血CD4+CD25+T细胞可为免疫治疗的剂量及方案调整提供参考。

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（收稿日期：2020-01-09） （本文编辑：姬思雨）