遵义市城区儿童地中海贫血发病情况及基因分布分析

2016-12-03陈雪梅田润梅黄美颖张云梅李志马一翔陈艳

山东医药 2016年38期

关键词：肽链珠蛋白初筛

陈雪梅,田润梅,黄美颖,张云梅,李志,马一翔，陈艳

(遵义医学院附属医院,贵州遵义563000)

遵义市城区儿童地中海贫血发病情况及基因分布分析

陈雪梅,田润梅,黄美颖,张云梅,李志,马一翔，陈艳

(遵义医学院附属医院,贵州遵义563000)

目的调查遵义市城区儿童地中海贫血发病情况,并分析其基因分布。方法选择遵义市城区学生为研究对象,共纳入2 579名儿童。对研究对象进行地中海贫血初筛,根据筛查结果,对可疑地中海贫血患儿进行基因诊断,并行基因分析。结果 2 579名儿童初筛共511例为可疑地中海贫血,男性和女性α地中海贫血、β地中海贫血检出率无显著差异(P均>0.05)。221例初筛为可疑α地中海贫血,经基因诊断确诊54例；290例初筛为可疑β地中海贫血,经基因诊断确诊90例。α地中海贫血中,--SEA/αα基因型构成比最高(66.7%),其次为--SEA/-α3,7基因型(18.5%)；β地中海贫血中,CD41-42(-CTTT)/N基因型最高(36.7%),其次为IVS-2-654(C→T)/N基因型(16.7%)。α地中海贫血基因检出频率--SEA等位基因数最高,检出频率76.3%；β地中海贫血CD41-42(-CTTT)的等位基因数最高,检出频率45.2%。结论遵义市城区儿童地中海贫血发病率较高,基因分布情况复杂,应加强常规筛查及基因学诊断。

地中海贫血；儿童；发病状况；基因分布；遵义城区

地中海贫血是一种遗传性溶血性贫血,与遗传基因缺陷有关,我国南方发病率较高[1,2]。轻型地中海贫血可不需要特殊治疗,中间型和重型需要给予相应治疗。了解地中海贫血在本地区的流行情况,对预防和控制具有重要指导意义,而对地中海贫血携带者进行基因诊断、筛查等是疾病控制的主要方法[3]。2016年1月1日～5月31日,我们对遵义市城区儿童的地中海贫血发病情况进行调查,并分析基因分布情况。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象以遵义市城区学生为研究对象,共纳入2 579名儿童。其中男1 748例、女831例,年龄11～13岁。

1.2 调查方法抽取受检者ACD抗凝血2 mL,将血红蛋白(Hb)含量调至10 g/L。采用前以自动Hb电泳仪进行电泳,出现异常快速带的标本,加入pH 6.5磷酸缓冲液电泳,确定HbH或Hb Bart。将确定的标本冻存。HbA2<2.5%者结合红细胞形态、临床表现、Heniz小体阳性等,定位可疑α地中海贫血；HbF、HbA2水平超过范围者,结合临床表现、红细胞形态,定位可疑β地中海贫血；HbF>60%,结合严重的溶血性贫血、幼年发病、肝脾肿大等临床表现,调查家系后,符合者定位β0地中海贫血,其余为β+地中海贫血。采用EDTA抗凝的全血,以DNA快速提取技术提取地中海贫血患儿的DNA。α地中海贫血缺失基因诊断采用单管多重PCR扩增技术检测待检DNA,总反应体系25 μL。反应条件：96 ℃变性15 min,98 ℃ 45 s,64 ℃ 90 s,72 ℃延伸3 min,共进行35个循环,然后72 ℃延伸5 min。β地中海贫血可疑基因诊断采用PCR-RDB方法检验,β珠蛋白基因扩增,生物素标记反向点杂交。统计地中海贫血的检出率,分析检出基因型及构成比,比较不同性别患儿地中海贫血的检出率。

1.3 统计学方法采用SPSS11.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同性别可疑地中海贫血检出率比较 2 579名儿童初筛共511例为可疑地中海贫血,其中可疑α地中海贫血221例、可疑β地中海贫血290例；男性可疑α地中海贫血、β地中海贫血的检出率分别为8.92%、10.93%,女性分别为7.82%、11.91%,不同性别比较无显著差异(P均>0.05)。见表1。

2.2 可疑地中海贫血者基因诊断结果 221例初筛为可疑α地中海贫血,经基因诊断确诊54例；290例初筛为可疑β地中海贫血,经基因诊断确诊90例。α地中海贫血中,--SEA/αα基因型构成比最高,(66.7%),其次为--SEA/-α3,7基因型(18.5%)。β地中海贫血中,CD41-42(-CTTT)/N基因型最高(36.7%),其次为IVS-2-654(C→T)/N(16.7%)。见表2。α地中海贫血基因检出频率--SEA等位基因数最高,占76.3%；β地中海贫血CD41-42(-CTTT)的等位基因数最高,占45.2%。见表3。

表1 不同性别可疑地中海贫血检出情况比较(例)

表2 α地中海贫血及β地中海贫血的基因型分布

3 讨论

地中海贫血是遗传性珠蛋白基因发生突变、缺失等缺陷导致的一种或者多种珠蛋白肽链生物合成减少或者完全不能合成,因此珠蛋白肽链间的正常平衡不能维持,同时正常成人型Hb合成降低的一种遗传性血红蛋白病[4,5]。我国长江以南的省份是地中海贫血的高发区,尤其广西、广东、海南、四川等省多发,而贵州也是高发区之一。

Hb由血红素和珠蛋白组成,血红素包括原卟啉与二价铁离子,珠蛋白包括1对α类肽链和1对非α类肽链[6,7]。珠蛋白肽链可分为两大类,α类肽链基因定位在16号染色体上(α,ξ),非α类肽链基因定位在11号染色体上(β,δ,γ,ε)。成人Hb包括HbA(α2β2)、HbA2(α2δ2),胎儿Hb包括HbF(α2γ2),胚胎Hb包括Gower1(ξ2ε2)、Gower2(α2ε2)、Potland(ξ2γ2)。胚胎9周后就会出现成人型Hb。α、β、及δ肽链见于成人正常Hb[8]。根据肽链合成障碍的不同,地中海贫血分为α、β、δβ、γδβ地中海贫血。地中海贫血的发病机制：一种或者多种珠蛋白基因缺陷,导致一种或者多种珠蛋白肽链合成减少或者缺如,导致其他类型珠蛋白肽链相对过多,珠蛋白肽链合成间平衡异常,正常Hb生物合成降低,导致贫血；过多的珠蛋白肽链沉积在红细胞,导致红细胞遭到破坏,出现无效造血和溶血,导致骨髓造血代偿性增强,可引起肝脾肿大、骨骼病变、肠道铁吸收增加,加上输血治疗可继发性铁负荷增多[9,10]。

表3 α地中海贫血及β地中海贫血等位基因分布

α地中海贫血是α珠蛋白基因缺失,导致α肽链合成障碍。根据α珠蛋白基因缺失的程度不同,分为Hb Bart胎儿水肿综合征、HbH病[11]、标准型α地中海贫血、静止型α地中海贫血[12]。严重的α地中海贫血可表现为早产、死产或者生后不久死亡,存活患儿可出现严重贫血、黄疸、肝脾肿大、心脏扩大、水肿及胸腔、心包、腹腔积液[13]。实验室检查,血象显示小细胞低色素性贫血,网织红细胞升高；骨髓象显示增生性贫血骨髓象,红细胞渗透脆性下降,出现Heinz小体,异丙醇试验阳性；Hb电泳,初生新生儿Hb Bart大约为25%,HbH较少,随着年龄的增长,Hb Bart下降,而HbH升高,年长儿主要以HbH为主,Hb Bart微量。标准型α地中海贫血临床无症状或者症状轻微,无或者仅有轻微的贫血和血常规改变,容易误诊为低色素营养性贫血。静止型α地中海贫血可无任何症状以及血常规改变,仅在家系调查或者脐带血Hb普查中才发现。本次研究中可疑α地中海贫血筛查检出率为8.57%。

β地中海贫血包括β0地中海贫血和β+地中海贫血,前者是β基因突变导致β肽链完全不能合成,后者是β基因突变导致β肽链部分不能合成[14]。编码区移码突变、起始密码突变形成无功能mRNA,不能合成正常的β链,产生β0地中海贫血。非编码区突变影响mRNA的剪切加工过程,形成异常mRNA,不能合成正常β链或者合成减少,导致β0或者β+地中海贫血；影响转录的突变导致转录速率下降,mRNA生成减少,产生β+地中海贫血。β珠蛋白基因缺失,导致β0地中海贫血；γ、δ、β基因连锁在一起,根据基因缺失长短不同,产生δβ、γδβ地中海贫血[15]。β基因突变有100多种,国内常见的有6种。CD41-42(-CTTT)：缺失4个碱基,导致框架突变,终止密码提前出现,几乎无β链合成,为β0地中海贫血,本次研究中检出频率为38.3%。IVS-2-654(C→T)：内含子Ⅱ中654位点C→T碱基替换,导致潜在的拼接位点活化,mRNA加工异常,不能翻译为正常的β链。CD17(A→T)：导致终止密码TAG形成,β链不能合成。-28(A→T)：突变位于起始位点上游的启动子TATA盒,转录效率降低,mRNA生成量减少。CD71-72(+A)：在71和72插入1个碱基A,造成阅读框架改变,mRNA不能翻译为正常β链。CD26(G→A)：β链26密码子由G变A,影响mRNA加工,βE mRNA合成减少,β链减少。重型β地中海贫血Hb<60 g/L,小细胞低色素性贫血,易见靶形红细胞；骨髓象表现为增生性贫血骨髓象,红细胞脆性下降,HbF升高,HbA2正常；X线检查可见颅骨内外板变薄,髓腔增宽,骨小梁增粗。患儿常常需要终生输血,如果不治疗,多在5岁前死亡。中间型β地中海贫血,临床症状介于轻型和重型之间,中度贫血,肝脾轻中度肿大,可有黄疸,骨骼变化轻。血象表现为小细胞低色素性贫血,骨髓象表现为增生性贫血骨髓象,红细胞脆性降低,HbF升高,HbA2正常或者升高。患儿可能需要输血,患者可活至成年甚至老年。轻型β地中海贫血表现为无症状或者仅有轻度贫血,可有轻度脾大,大多在家系调查时发现。血象检查红细胞形态正常或者轻度改变,红细胞脆性正常或者降低,HbA2升高,HbF正常,患者寿命正常。

本研究结果显示,α地中海贫血中,--SEA/αα基因型构成比最高,其次为--SEA/-α3,7基因型；β地中海贫血中,CD41-42(-CTTT)/N基因型最高,其次为IVS-2-654(C→T)/N。α地中海贫血基因检出频率--SEA等位基因数最高,而β地中海贫血CD41-42(-CTTT)的等位基因数最高。这与我国的基本情况相似：在我国南方,导致α地中海贫血的分子基础主要是α珠蛋白基因簇3种大的缺失,包括-α3,7和-α4,2两种单基因缺失和--SEA(东南亚型缺失),而--SEA在我国最常见。α地中海贫血临床表现及血液学阳性指标标准型、HbH病筛查结果阳性率高,而静止型筛查率较低,说明静止型在筛查中难以检出。β地中海贫血患儿轻型表现较多,说明β遵义市城区是地中海贫血的高发区,应加强婚前检查、产检等,同时应加强筛查强度以及基因诊断,采取有效措施,保障患者健康。

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