ERK通路阻滞剂PD98059对心肺复苏大鼠脑组织SOD表达和细胞凋亡的影响

舒泉，陈蒙华，阮氏芳英，王慧慧，谢露

(广西医科大学，南宁530021)



ERK通路阻滞剂PD98059对心肺复苏大鼠脑组织SOD表达和细胞凋亡的影响

舒泉，陈蒙华，阮氏芳英，王慧慧，谢露

(广西医科大学，南宁530021)

目的 观察ERK通路阻滞剂PD98059(PD)对心肺复苏(CPR)后大鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)表达以及脑细胞凋亡的影响。方法 采用经食管交流电刺激诱导心室颤动建立大鼠心脏骤停/心肺复苏 (CA/CPR)模型，将恢复自主循环(ROSC)的48只大鼠随机分成PD组和模型组各24只，分别静脉注射PD 0.3 mg/kg及等量生理盐水；选择6只大鼠为假手术组，只行手术操作不诱导CA/CPR。分别于ROSC后12、24、48、72 h时各处死6只大鼠，取脑组织；用免疫荧光标记法检测大脑皮层组织SOD1、SOD2荧光密度及Caspase3阳性细胞，TUNEL法检测凋亡细胞。结果 与模型组比较，PD组各时点SOD1荧光密度均明显升高(P均<0.05)，PD组ROSC后12、24、48 h时SOD2荧光密度均明显升高(P<均0.05)。ROSC后72 h，模型组、PD组Caspase3阳性表达率、脑细胞凋亡率均高于假手术组，而PD组Caspase3阳性表达率、脑细胞凋亡率低于模型组，P均<0.05。结论 PD治疗能提高CA/CPR后模型大鼠脑组织SOD表达水平，抑制脑细胞凋亡。

心脏骤停；心肺复苏；细胞外调节蛋白激酶通路阻滞剂；细胞凋亡；超氧化物歧化酶；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

在心脏骤停(CA)患者中，心肺复苏(CPR)后的成活率较低[1]；即使恢复自主循环(ROSC)成功者，仅3%～7%的患者能够完全康复[2，3]。研究发现，活性氧(ROS)过度产生在缺血/再灌注(I/R)脑细胞损伤中起重要作用[4～6]。ROS过度产生可造成脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤，最终导致细胞死亡[7]。此外，ROS还能对某种信号通路具有活化或者抑制作用[8，9]。ROS可通过抑制活化蛋白磷酸酶的活性，导致细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2信号通路激活[10]。PD98059(PD)是ERK通路阻滞剂。本课题组先前研究已证实[11，12]，CPR大鼠脑细胞凋亡与ERK通路关系密切，PD可明显延长心室颤动大鼠CPR后的生存时间。PD治疗是否能够促进脑内超氧化物歧化酶(SOD)生成，提高大鼠内源性抗氧化能力，从而产生抗凋亡作用，尚不明确。2015年6～10月，我们建立CA/CPR模型，探究PD对CA/CPR后脑组织SOD表达和脑细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组与造模干预 健康的SD大鼠54只，体质量230～380 g，不拘雌雄，由广西医科大学实验动物中心提供。采用经食管交流电刺激诱导心室颤动[14]建立大鼠CA/CPR模型，将ROSC[13]的48只大鼠随机分成PD组和模型组各24只，分别静脉注射PD 0.3 mg/kg及等量生理盐水；选择6只大鼠为假手术组，只行手术操作不诱导CA/CPR。

1.2 脑组织标本采集 分别于ROSC后12、24、48、72 h时各取6只，予腹腔麻醉后立即断头处死，取完整脑组织-80 ℃冰箱保存。实验结束后，取脑组织，制作石蜡切片。

1.3 脑组织SOD1、SOD2荧光密度测定 采用免疫荧光法。取脑组织石蜡切片，60 ℃烤片30 min；用二甲苯浸洗3次，每次10 min；梯度乙醇各浸泡1次，每次5 min；用自来水冲洗玻片上残留的乙醇，PBS洗3次，每次5 min；将玻片放置在柠檬酸钠溶液(pH 6.0)中高压煮沸5 min,修复组织抗原；抗原修复完后，放到冰水中冷却；PBS洗3次，每次5 min。以3.0%～3.5%的过氧化氢覆盖组织，37 ℃恒温箱中放置10 min消除内源性过氧化物酶对荧光的影响。PBS洗3次，每次5 min；加一抗(产品号：ab13498和ab13534，浓度1∶200，美国Abcam公司)孵育，4 ℃过夜；PBS洗3次，每次5 min；以二抗(产品号：ab150079，浓度1∶300，美国Abcam公司)孵育，37 ℃恒温箱中1 h，注意避光。用PBS洗3次，每次5 min；以DAPI(武汉博士德公司)染核2 min，再用PBS洗3次，每次5 min；滴加适量抗荧光衰减封片剂(上海Solarbio公司)，封片。200倍光镜下，用共轭双聚焦显微镜(日本Nikon公司)拍5个不同视野的荧光图像，避免拍到有自发荧光的切片边缘，并用专业软件测定荧光密度。

1.4 脑组织Caspase3阳性细胞检测 采用免疫荧光法。取脑组织石蜡切片，处理同1.3。以一抗(产品号：ab32351，浓度1∶200，美国Abcam公司)孵育，4 ℃冰箱中过夜；PBS洗3次，每次5 min；以二抗(产品号：A02110，浓度1∶100，美国Abbkine公司)孵育，37 ℃恒温箱中1 h，注意避光；PBS漂洗3次，玻片干后加DAPI常温反应2 min；PBS漂洗3次，玻片干后滴加抗荧光封片剂封片。200倍光镜下，每组切片拍摄5个阳性视野，以(Caspase3阳性细胞个数/高倍视野下细胞数)×100%计算Caspase3阳性细胞率。

1.5 脑细胞凋亡情况观察 采用TUNEL法。取脑组织石蜡切片，处理同1.3；玻片干后滴加50 μL的TUNEL反应混合液 (50 μL TdT+450 μL荧光素标记的dUTP液混匀，德国Roche公司)，在暗湿盒中在37 ℃孵育1 h；PBS漂洗3次，每次5 min。玻片干后加DAPI常温避光反应2 min，PBS漂洗3次，玻片干后滴加抗荧光封片剂封片。200倍光镜下，每组切片拍摄5个阳性视野，以(TUNEL阳性细胞数/高倍视野下细胞数)×100%计算细胞凋亡率。

2 结果

2.1 各组大鼠脑组织不同时点SOD1、SOD2荧光密度比较 见表1。

表1 各组大鼠脑组织不同时点SOD1、SOD2荧光密度比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.2 各组脑组织Caspase3阳性表达率比较 ROSC后72 h，假手术组Caspase3阳性表达率为30.6%±6.7%，模型组为52.3%±4.2%,PD组为37.4%±12.5%；模型组、PD组Caspase3阳性表达率均高于假手术组，而PD组Caspase3阳性表达率低于模型组，P均<0.05。

2.3 各组脑细胞凋亡率比较 ROSC后72 h，假手术组脑细胞凋亡率为37.0%±4.8%，模型组为67.5%±13.2%,PD组为48.6%±1.3%；模型组、PD组脑细胞凋亡率均高于假手术组，而PD组脑细胞凋亡率低于模型组，P均<0.05。

3 讨论

大鼠在行CA/CPR治疗后，氧化应激相关通路被激活，ROS表达迅速增加，抗氧化酶相对不足，是导致组织损伤的重要原因[10，11]。有研究表明，外源性SOD能明显减轻动物模型的缺血再灌注损伤[12，13]。SOD按其金属辅基的不同可分为3种：第1种叫Cu-Zn-SOD(SOD1)，呈绿色，金属辅基为Cu、Zn，主要表达在机体细胞质中；第2种叫Mn-SOD(SOD2)，呈紫色，金属辅基为Mn，主要表达在原核细胞中和真核细胞的线粒体；第3种叫Fe-SOD，呈黄褐色，主要表达在原核细胞中。本研究选用大鼠建立CA/CPR模型，探究PD对脑组织SOD表达及脑细胞凋亡的影响。研究发现，模型组脑组织SOD1和SOD2在ROSC后12、24、48 h时的荧光密度均较假手术组低，说明大鼠在实施CPR治疗后，大鼠体内对抗氧化应激损伤的能力明显下降。PD干预治疗后，大鼠脑组织中SOD1、SOD2各时间点的荧光密度均较模型组强，提示PD治疗能明显提高脑组织SOD1和SOD2的表达水平。本课题组前期的研究发现，CA/CPR大鼠在氧化应激后ROS活性升高与脑细胞的凋亡关系密切[11，12]，而SOD是ROS最强有力的清除剂。由此可推测，SOD对脑细胞的保护作用是通过对ROS的清除来实现的。ROS可促进ERK 通路的激活[10]，所以在模型组中ERK通路被ROS长期过度激活是造成脑细胞凋亡的重要原因。而在PD组中，ERK通路阻滞剂PD阻断了ERK通路，有效抑制了氧化应激作用的信号传导，所以PD组的脑细胞凋亡明显较少。SOD1和SOD2表达峰值都出现在ROSC后48 h，提示CPR后大鼠氧化应激是一种长时程反应。

在细胞凋亡进程中，细胞核的形态变化和Caspase3的表达起着重要的提示作用。Caspase是一种很普遍的细胞凋亡驱动器，其活化是细胞程序化死亡中细胞蛋白裂解的一个重要环节[14]。活化的Caspase3能导致DNA片段化、凋亡小体形成和神经细胞死亡。本次研究结果表明，PD组Caspase3阳性和TUNEL阳性细胞的数量明显比模型组少，提示PD治疗有抗凋亡作用，这种作用可能与SOD1和SOD2的表达增加有关。有研究表明，大鼠在氧化应激时，细胞Caspase3的表达会增多，TUNEL阳性细胞数量也会相应增多[15]。但本次研究提示,TUNEL阳性细胞明显比Caspase3阳性细胞多，提示大鼠I/ R过程中，除Caspase3外，还有其他相关凋亡蛋白参与了凋亡。

由此可见，CPR后ERK通路被ROS长时间过度激活对脑细胞存活是不利的。在PD治疗后，脑细胞的凋亡明显受到抑制，但还是有部分细胞出现凋亡，可见还有其他通路参与了脑细胞凋亡过程，具体作用机制有待进一步研究。

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Effects of ERK channel blocker PD98059 on SOD expression and apoptosis of brain tissues after CPR in rats

SHUQuan,CHENMenghua,RUANSHIFangying,WANGHuihui,XIELu

(GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To observe the effects of ERK channel blocker PD98059 on the expression of superoxide dismutase (SOD) and apoptosis of brain tissues after cardio-pulmonary resuscitation (CPR) in rats.Methods We used the alternating current of the esophagus stimulation to induce the ventricular fibrillation and establish the cardiac arrest/cardiopulmonary resuscitation (CA/CPR) model. Forty-eight rats, once spontaneous circulation restoring (ROSC), were divided into two groups: PD98059 (PD) group (treated with 0.3 mg/kg, intravenous intravenously,n=24) and model group (injected with same amount of normal saline,n=24). The control group (SH) was treated without CA/CPR (n=6). In each group, we executed 6 rats to obtain the brain tissues at 12, 24, 48 and 72 h after ROSC. The SOD1, SOD2 fluorescence density and positive cells of Caspase-3 in the cerebral tissues were detected by immunofluorescence labeling method, and the apoptosis by TUNEL labeling method. Results After CPR, the SOD1 fluorescence density of the PD group was all higher than that of model group at each time points (allP<0.05). The SOD2 fluorescence density of the PD group was significantly increased at 12, 24 and 48 h (allP<0.05). At 72 h after ROSC, Caspase-3 positive expression rate and the apoptosis rate of the PD group and model group was significantly higher than that of the control group, and the Caspase-3 positive expression rate and apoptosis rate of the PD group was lower than that of the model group (allP<0.05). Conclusion PD98059 can improve the SOD expression and inhibit apoptosis of brain tissues of rats after CA/CPR.

cardiac arrest; cardio-pulmonary resuscitation; extracellular regulated protein kinases channel blocker; apoptosis; superoxide dismutase; Caspase-3

国家自然科学基金资助项目(81160231)。

舒泉(1989-)，男，硕士研究生，主要研究方向为心血管基础。E-mail： 497462239@qq.com

简介：谢露(1959-)，女，博士，博士生导师，主要研究方向为心血管基础。E-mail： xielu8282@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.005

R541

A

1002-266X(2016)38-0016-03

2016-04-23)