miR-100对裸鼠食管鳞状细胞癌移植瘤生长的影响

张乃键，蒋森，吴钦良，赵亚萍

(1中国人民解放军第82医院，江苏淮安223001；2上海市东方医院；3南京医科大学附属淮安市第一人民医院)



miR-100对裸鼠食管鳞状细胞癌移植瘤生长的影响

张乃键1，蒋森2，吴钦良3，赵亚萍1

(1中国人民解放军第82医院，江苏淮安223001；2上海市东方医院；3南京医科大学附属淮安市第一人民医院)

目的 观察miR-100对裸鼠食管鳞状细胞癌(ESCC)移植瘤生长的影响。方法 将人ESCC细胞株Kyse150皮下注射裸鼠腋部，成瘤后将瘤块接种于21只裸鼠右侧腋下；待肿瘤体积增至200 mm3左右时，将裸鼠随机分为A、B、C组各7只，分别于瘤内注射50 μg/mL的miR-100-mimics、50 μg/mL的mimics-NC、转染剂100 μL，1次/d，连续21 d。其间每隔1 d测量并记录肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；实验结束后剥离肿瘤组织，称量肿瘤质量。结果 干预后第5～7天B、C组肿瘤快速生长，且随时间延长体积逐渐增大，与A组之间差异无统计学意义(P均>0.05)；而第9天后A组肿瘤生长受到抑制，肿瘤生长缓慢，几乎停滞，体积明显小于B、C组(P均<0.05)。干预后第21天，A组荷瘤裸鼠移植瘤质量为(0.115±0.087)g，明显低于B组的(0.370±0.361)g和C组的(0.289±0.472)g，差异有统计学意义(P均<0.05)。结论 miR-100可以抑制ESCC裸鼠皮下移植瘤的生长。

食管癌；微小核糖核酸-100；Kyse150细胞；移植瘤；抑制作用；裸鼠

食管鳞状细胞癌(ESCC)是食管癌的主要病理类型，以高发病率和地域差异的病死率为特征。微小RNA(miRNA)是一类小的非编码RNA，其在癌症发生和发展相关基因的调节中起重要作用。近来越来越多的研究证实，异常表达的miRNA可能在ESCC发病过程中起重要作用。本课题组前期研究发现，miRNA-100(miR-100)显著低表达于ESCC癌组织，且与ESCC淋巴结转移有关；体外研究结果表明，miR-100过表达可显著抑制ESCC细胞迁移和侵袭，但对ESCC细胞增殖和凋亡均无明显影响[1]。2012年3～6月，我们观察了miR-100对裸鼠ESCC移植瘤的作用，探讨miR-100参与ESCC的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人ESCC细胞株Kyse150购自美国模式培养物集存库(ATCC)。BALB/c雌性裸小鼠30只，4～5周龄，体质量14～16 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于昭衍(苏州)新药研究中心有限公司动物房。RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司，PBS、胰蛋白酶、台盼蓝染液均购自美国Invitrogen公司，DMSO购自美国Sigma公司；miR-100-mimics及相关的阴性对照(mimics-NC)购自上海吉玛制药技术有限公司，动物体内转染试剂(Entranster)购自北京Engreen公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 Kyse150细胞用RPMI 1640培养基加10%胎牛血清，在37 ℃含5% CO2的细胞孵箱中培养。细胞每2～3 d换液1次，待细胞融合至80%～90%时，以胰蛋白酶消化液消化成单个细胞用于传代，传代比例为1∶3。 经数代培养后，待细胞处于对数生长期时收集细胞。

1.2.2 肿瘤细胞悬液制备 待细胞处于对数生长期时消化细胞，用吸管轻轻吹打，吸取100 μL细胞悬液至EP管内。加入100 μL台盼蓝染色液，轻轻吹打混匀，3～5 min后取20 μL滴板计数。于大方格内计数未被蓝染的细胞总数，即为活细胞数。将剩余细胞悬液吸入10 mL离心管中，平衡后将离心管放入台式离心机中，以1 000 r/min离心5 min。弃上清液，依据台盼蓝染色计算的细胞浓度，加入适量不含血清的培养液，用滴管轻轻吹打细胞，制成浓度为5×107/mL的单细胞悬液。

1.2.3 ESCC动物模型建立 选择体质量18～22 g、4～5周龄裸鼠9只，腋部皮下注射0.2 mL单细胞悬液。接种第2周开始成瘤，第3～4周后肿瘤长至200 mm3左右；选择肿瘤生长旺盛荷瘤种鼠，剥离瘤块。尽量剔除肿瘤坏死组织和带血管的肿瘤间质，将瘤组织切成1.5～3.0 mm3的均匀小块；将其接种于裸鼠右侧腋下距腋窝1.5～2.0 cm处，接种21只。将裸鼠放回笼中继续饲养，密切观察动物状态及肿瘤生长情况。第5天可见移植瘤块生长，成瘤率100%。第20天前后肿瘤长至体积约100 mm3，提示建模成功。

1.2.4 动物分组及干预处理 待肿瘤体积增至200 mm3左右时，将21只裸鼠随机分为A、B、C组各7只，分别于瘤内注射50 μg/mL的miR-100-mimics(5 μg miR-100+8 μL转染剂+92 μL PBS)、50 μg/mL mimics-NC(5 μg mimic+8 μL转染剂+92 μL PBS)、转染剂(8 μL 转染剂+92 μL PBS)100 μL；药液注射瘤体的中心部位，并在肿瘤外周基底部分点注射。1次/d，连续21 d。

1.2.5 移植瘤体积及质量测定 给药后每隔1 d测量瘤体积。肿瘤体积=1/2×长径×短径2，绘制肿瘤生长曲线。实验结束后安乐死处死动物，剥离肿瘤组织并称量。

2 结果

干预后第5～7天B、C组肿瘤快速生长，且随时间的延长体积逐渐增大，与A组之间差异无统计学意义(P均>0.05)。而第9天后A组肿瘤生长受到抑制，肿瘤生长缓慢，几乎停滞，体积明显小于B、C组(P均<0.05)。见表1。干预后第21天，A组荷瘤裸鼠移植瘤质量为(0.115±0.087)g，明显低于B组的(0.370±0.361)g和C组的(0.289±0.472)g，差异有统计学意义(P均<0.05)。

表1 各组荷瘤裸鼠移植瘤体积比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

我国是世界食管癌高发区域之一，组织类型主要为ESCC[2]，其发病呈现明显的地域分布特征，全国共有7个高发区，江苏北部地区即是其中之一[3]。尽管食管癌手术水平不断提高，放疗化疗设备及药物不断更新，但手术患者术后5年生存率仅为20%[4]。大量文献报道，许多miRNA参与了对肿瘤发生机制的调控，起到抑癌或致癌基因的作用。近年来，高通量检测发现多种miRNA在食管癌组织中异常表达[5～9]，且与肿瘤的发生、发展关系密切。

miR-100位于人类基因组11q24.1中，进化上高度保守，在果蝇、鲐、鼠及猩猩等近100种动物中均存在表达，提示其在生命活动中的重要功能。miR-100的靶基因功能主要涉及基因沉默、负性调节细胞的生物合成等生物学过程，涉及肿瘤信号通路、凋亡信号通路等。研究发现，miR-100参与多种人类肿瘤的发生机制。目前已有报道称，miR-100在不同肿瘤中的表达与作用并不一致，为此很多学者对miR-100进行了深入研究。Li等[10]发现，miR-100低表达于不同等级的宫颈上皮内瘤样病变及宫颈癌中，体外研究表明miR-100可抑制宫颈癌细胞生长；体内实验发现，miR-100与保罗样激酶1(PLK1)蛋白表达呈负相关，该关系在宫颈癌中更明显，表明miR-100与PLK1在宫颈癌的发展中起重要作用。根据实体肿瘤具有低氧的特性，Blick等[11]研究发现，在低氧情况下，膀胱癌细胞内miR-100表达下调；体外miR-100过表达会导致下游磷酸化的促有丝分裂信号蛋白MAPK和PKB激酶减少，进而抑制细胞的有丝分裂，表明miR-100抑制膀胱癌的发生。Akbari等[12]研究证实，miR-100或miR-99a受到miR-125b的协同作用抑制下游相关基因，共同促发儿童急性淋巴细胞白血病的长春新碱抵抗，起到致癌基因的作用。可见，miR-100在不同肿瘤类型、不同环境影响下作用各异。因此，miR-100调控关系网络复杂、生物学功能及调控机制尚不十分清楚。

本实验基于前期研究，观察了miR-100对ESCC裸鼠移植瘤生长的影响。结果显示，miR-100对裸鼠皮下移植瘤的生长抑制作用明显，于治疗第9天开始肿瘤的体积显著减小，且随治疗时间的延长，抑制作用仍然较佳。表明miR-100过表达能快速有效地抑制肿瘤在体内的增殖，虽然前期体外研究结果显示miR-100对ESCC细胞增殖和凋亡均无明显影响。但由于miRNA在体内的作用机制复杂，通常一个miRNA可以调控多个基因的功能，而同一基因又受多个miRNA的特异调控，复杂的调控网络可能放大了miR-100的抑瘤作用。然而，目前miR-100的复杂关系网络研究还不成熟，其调控机制还需进一步研究。

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江苏省自然科学基金资助项目(BK2012666)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.011

R735.1

A

1002-266X(2016)38-0035-03

2015-11-20)