急性出血坏死性胰腺炎大鼠血清二胺氧化酶水平变化及意义

兰涛,崔乃强

(1天津中医药大学研究生院,天津300193;2沧州市人民医院;3天津市南开医院)



急性出血坏死性胰腺炎大鼠血清二胺氧化酶水平变化及意义

兰涛1,2,崔乃强3

(1天津中医药大学研究生院,天津300193;2沧州市人民医院;3天津市南开医院)

目的 观察急性出血坏死性胰腺炎(AHNP)大鼠血清二胺氧化酶(DAO)水平变化，并探讨其意义。方法 选取60只健康雄性Wistar大鼠，随机分为假手术组和AHNP组各30只。AHNP 组胆胰管逆行注射3.5%牛磺胆酸钠建立 AHNP 动物模型，假手术组以同样方法注射生理盐水。各组大鼠分别于造模后6、12、24 h取腹主动脉血，用ELISA法检测血清DAO，取末端回肠组织行病理学观察和回肠黏膜损伤Chiu′s评分。结果 假手术组造模后各时点血清DAO差异无统计学意义。AHNP组造模后随时间延长血清DAO水平逐渐升高，均较同时点假手术组高，P均<0.05。肉眼及光镜下观察假手术组末端回肠组织无明显异常，AHNP组造模后肠黏膜损伤程度进行性加重。假手术组造模后各时点肠黏膜 Chiu′s评分均为0分；AHNP组造模后6、12、24 h肠黏膜Chiu′s评分分别为(2.20±0.43)、(3.14±0.36)、(4.19±0.52)分，P均<0.05。AHNP组造模后 6、12、24 h血清DAO与回肠黏膜Chiu′s评分均呈正相关关系，相关系数分别为0.639、0.929、0.726，P均<0.05。结论 AHNP大鼠血清DAO水平升高，外周血清DAO水平变化可间接反映肠黏膜损伤程度。

急性出血坏死性胰腺炎；肠黏膜屏障；二胺氧化酶；Chiu′s评分

重症急性胰腺炎(SAP)是一种临床上常见的急腹症，发病急骤，进展迅速，病死率高。SAP可早期导致全身炎症反应综合征(SIRS)，导致肠黏膜损伤和肠屏障功能障碍,继发感染和多器官功能障碍(MODS)[1，2]，但其具体机制不明。急性出血坏死性胰腺炎(AHNP)是SAP的一种常见类型。2015年5～8月，我们观察了AHNP大鼠血清二胺氧化酶(DAO)水平变化及肠黏膜损伤情况，并分析二者的相关性。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠60只，体质量(250±50)g，由中国医学科学院实验动物研究所提供。牛磺胆酸钠为美国Sigma公司产品；大鼠血清DAO检测ELISA试剂盒为美国UCL公司产品；高速离心机为美国Beckman 公司产品；光学显微镜为日本Olympus公司产品。

1.2 动物分组及AHNP模型建立 将大鼠按随机数字表法分为假手术组和AHNP组，每组30只。AHNP组采用逆行胆胰管注射法制备AHNP模型[3]。大鼠术前禁食不禁水12 h，用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后固定于手术台，备皮，做长约2 cm 腹部正中切口入腹。找到十二指肠乳头并穿刺乳头对侧十二指肠肠壁，用24 号静脉留置针逆行插入胆胰管0.5 cm；向胆胰管内注入3.5%牛磺胆酸钠1 mL/kg，速度为0.15 mL/min。假手术组以同样方法给予生理盐水注射。缝扎十二指肠穿刺口，关腹，将动物置于清洁、通风的动物室内观察。

1.3 血清DAO检测方法 造模后6、12、24 h取两组大鼠腹主动脉血，3 000 r/min离心10 min分离血清,用ELISA法检测血清DAO，操作按试剂盒说明书进行。

1.4 肠黏膜病理观察方法 造模后6、12、24 h各处死10只大鼠，取末端回肠组织。常规固定、包埋、连续切片，HE染色。肉眼及光学显微镜下观察小肠组织病理学变化，光镜观察黏膜损伤程度并行Chiu′s评分。肠黏膜正常评0分；绒毛顶端上皮下间隙增宽伴毛细血管充血评1分；上皮下间隙进一步增宽伴随上皮层与固有膜分离评2分；大片上皮层从绒毛两边分离并有少量绒毛脱落评3分；大片绒毛脱落后固有膜裸露评4分；固有膜被消化、分解、缺血改变和溃疡形成评5分。

2 结果

2.1 两组大鼠血清DAO比较 假手术组造模后各时点血清DAO差异无统计学意义。AHNP组造模后6、12、24 h血清DAO水平逐渐升高，P均<0.05；AHNP组血清DAO水平均较同时点假手术组高，P均<0.05。见表1。

表1 两组大鼠各时点血清 DAO 比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与同组造模后6 h比较，#P<0.05；与同组造模后12 h比较，△P<0.05。

2.2 两组末端回肠组织病理学变化比较 肉眼观察假手术组末端回肠组织肉眼观察无明显异常。AHNP组造模后6 h末端回肠组织充血水肿，可见散在点状出血；造模后12 h末端回肠组织充血水肿明显加重，伴片状出血及散在黑褐色坏死；造模后24 h末端回肠组织充血水肿进一步加重，大片出血及坏死，并有散在皂化斑。光镜下观察假手术组肠黏膜绒毛结构完整，上皮呈高柱状，间质无水肿、无中性粒细胞浸润。AHNP组造模后6、12、24 h各回肠黏膜损伤程度进行性加重，可见回肠间质水肿、散在出血，肠绒毛增粗，高度变短，黏膜厚度变薄，黏膜腺体减少排列稀疏，血管、淋巴管扩张，大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润。假手术组造模后各时点肠黏膜Chiu′s评分均为0分。AHNP组造模后6、12、24 h肠黏膜Chiu′s评分分别为(2.20±0.43)、(3.14±0.36)、(4.19±0.52)分，P均<0.05。

2.3 AHNP组各时间血清DAO与回肠黏膜Chiu′s评分的关系 AHNP 组造模后6、12、24 h血清DAO水平与回肠黏膜 Chiu′s评分均呈正相关关系，相关系数分别为0.639、0.929、0.726，P均<0.05。

3 讨论

SAP是临床常见的急腹症之一，它不仅引起胰腺本身及胰周的炎性肿胀、渗出和坏死，而且常导致全身重要脏器功能的损害[4]，是一种发病急、进展快、并发症多、病死率高的严重疾病[5]。SAP时常并发MODS，成为SAP的主要死亡原因[6]。AHNP是SAP的一种常见类型。AHNP大鼠肠黏膜血流量减少，肠上皮细胞凋亡增加，细胞间紧密连接损伤，肠黏膜通透性增加，肠屏障功能障碍，细菌易位，出现内毒素血症和多器官功能损伤，进一步加重肠道屏障功能障碍，最后出现肠功能衰竭[7]。

DAO是存在于哺乳动物小肠的黏膜或纤毛上皮细胞中，由脱氨酶激活具有催化二胺氧化功能的细胞内酶[9]。其在肝脏内进行代谢，可通过调节细胞内的离子平衡，影响传导通路，促进细胞修复，对肠黏膜具有保护作用。正常情况下，由于肠黏膜屏障的存在，肠黏膜组织细胞中的大分子物质不能进入外周血循环，外周血中DAO水平很低。小肠黏膜屏障功能衰竭时或肠黏膜细胞坏死时，肠黏膜屏障功能受损，小肠黏膜组织内DAO水平降低，血清和肠腔内DAO水平升高[10～14]。本研究使用3.5%牛磺胆酸钠溶液逆行注射大鼠胰胆管制备大鼠AHNP模型，观察AHNP发生后随着病程进展外周血DAO及末端回肠病理学表现的变化，研究AHNP患者发生肠黏膜屏障功能障碍的机制。结果显示，AHNP大鼠造模后6 h即出现肠壁充血、水肿及肠黏膜萎缩等损伤性改变，此时血清DAO水平亦明显升高，推测肠黏膜受损后DAO即从细胞内释放入血，导致上述表现；造模后12、24 h肠黏膜损伤进一步加重，血清DAO进一步升高，肠壁出现部分坏死，黏膜萎缩、小肠绒毛变短，术后24 h血清DAO达到高峰。同时发现，随着时间的延长，评估肠黏膜损伤的Chiu′s评分逐渐升高，提示AHNP大鼠肠黏膜损伤程度和血清DAO水平变化是同步的。本研究结果显示，AHNP组造模后6、12、24 h大鼠血清DAO与回肠黏膜Chiu′s评分均呈正相关关系，相关系数分别为0.639、0.929、0.726，亦支持上述观点。

综上所述，AHNP大鼠血清DAO水平升高，且与大鼠回肠黏膜损伤程度呈正相关；血清DAO检测具有方法简便、快捷、重复性好、结果稳定等优点，且为无创检查。因此，血清DAO可作为生物学标志用来反映AHNP大鼠肠屏障功能损伤状况。

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