利用DGGE分析窖泥复合功能菌液的细菌群落结构

刘颖，刘茂柯，任道群，姚万春，田新惠，张星宇，唐玉明*

（1.四川省农业科学院水稻高粱研究所生物中心，四川泸州646000；2.四川省泸州市酿酒科学研究所，四川泸州646000）

利用DGGE分析窖泥复合功能菌液的细菌群落结构

刘颖1，2，刘茂柯1，2，任道群1，2，姚万春1，2，田新惠1，2，张星宇1，2，唐玉明1，2*

（1.四川省农业科学院水稻高粱研究所生物中心，四川泸州646000；2.四川省泸州市酿酒科学研究所，四川泸州646000）

采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析窖泥复合功能菌液中各原料(窖泥、酒糟、大曲粉、黄水、己酸菌)对其细菌群落结构的影响。群落结构相似性分析结果显示，从窖泥复合功能菌液原配方中去除酒糟、己酸菌和黄水后进行培养，菌液细菌群落结构与窖泥复合功能菌液的相似性指数(Sc)仅为0.34；多样性指数分析结果显示，去除酒糟或己酸菌，细菌多样性指数(H)显著下降(p＜0.05)，去除己酸菌的窖泥复合功能菌液多样性指数(H)下降最为明显。结果表明，窖泥复合功能菌液中各组分对菌液的细菌群落结构存在一定影响，其中以己酸菌的影响最大。该研究为改良优化窖泥复合功能菌液的配方提供理论依据。

窖泥复合功能菌液；细菌群落结构；变性梯度凝胶电泳

浓香型白酒的生产是窖泥、糟醅、曲药微生物之间协同发酵的结果。窖泥作为浓香型白酒酿造的基础，在长期的酿酒发酵过程中，富集了大量的与产香有关的功能微生物，其质量的优劣在一定程度上决定着白酒的质量。目前，新建窖池扩大生产规模是企业提升竞争力的主要途径。但由于新窖窖泥的老熟程度较低，酿酒有益微生物驯化程度不高[1]，导致新窖白酒的酒质普遍较差。为促进新窖窖泥老熟，近年来我国学者展开了一系列的研究[2-4]。如杜礼泉等[5]利用窖泥己酸菌研发的窖泥复合功能菌液对退化窖泥进行改造，基础酒己酸乙酯含量比改造前提高一倍，优级品提高率达到32.83%，二级以上等级品提高率达到65.15%。前期，本课题组对人工窖泥复合功能菌液的配方进行了研究[6-8]，经过生产实践，改窖后曲酒中己酸乙酯的含量达到210 mg/100 mL以上，相比对照窖提高近50%，优质酒品率达40%左右，显著改善和提高浓香型白酒的质量。但是，相关研究对菌液研究配方和应用效果的较多，对功能菌液中微生物菌群结构的研究较少，这使窖泥功能菌液的进一步改进缺乏理论依据。

随着分子生物学技术的发展，变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）分析技术在白酒酿造过程中微生物群落分析方面已经有了广泛的应用[9-13]。为了深入探讨窖泥复合功能菌液的作用机理，本实验利用变性梯度凝胶电泳分析不同处理的窖泥复合功能菌液在培养过程中细菌的群落结构变化及其多样性信息，以期为进一步改进和优化窖泥复合功能菌液提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

窖泥、酒糟、黄水、大曲粉：四川省泸州市某知名酒厂；纯种己酸菌液：本实验室培养；化学培养基（乙酸钠1%、酵母膏0.1%、乙醇2%、磷酸二氢钾0.04%、硫酸铵0.05%、硫酸镁0.02%、碳酸钙1%）、磷酸、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、苯酚、氯仿、异戊醇、NaAc、异丙醇（分析纯）：成都科龙试剂有限公司；蛋白酶K（酶活力40 U/mg）：上海雅心生物技术有限公司。

1.2仪器与设备

K-2401-220型DGGE电泳仪：美国C.B.S.SCIENTIFIC公司；PTC-100型聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国ABI公司；SHA-C型数显恒温水浴振荡器：上海双捷实验设备有限公司；SW-CG-1F型超净工作台：苏州苏洁净化设备有限公司；DRP-9082型电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；YX-18LM型压力蒸汽灭菌器：江阴滨江医疗设备有限公司。

1.3方法

1.3.1窖泥复合功能菌液的不同配方

将化学培养基、窖泥、酒糟、大曲粉、黄水、己酸菌进行不同组合配比，其中A组为窖泥复合功能菌液（包括化学培养基、窖泥、酒糟、大曲粉、黄水、己酸菌6种组分）；B组为窖泥功能菌液不添加大曲粉；C组为窖泥功能菌液不添加酒糟；D组为窖泥功能菌液不添加窖泥；E组为窖泥功能菌液不添加己酸菌；F组为窖泥功能菌液不添加黄水，每个处理做3次重复，放在37℃恒温培养箱中培养，并在培养第15天采样，分别研究这5个组分对复合功能菌液细菌群落结构的影响。

1.3.2窖泥总DNA提取

窖泥总DNA提取参考潘玲玲等[14]的方法并略加改进，取0.5 g菌液沉淀于2 mL无菌的Eppendorf离心管中；加入1. 5mL磷酸提取液混匀，于-80℃冰箱冷冻30 min，65℃水浴融化，反复3次；加入10 μL蛋白酶K，于摇床37℃、220～250 r/min振荡30 min；加入200 μL 20%SDS，65℃水浴2 h，每隔20 min将液体混合摇匀；室温6 000 r/min离心10 min，上清液转入新的2 mL无菌离心管中；于上清中加0.5 mL体积分数为50%的PEG，4℃静置过夜；4℃、6 000 r/min离心30 min，弃上清，沉淀用1×TE溶解；加入0.5 mL苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1，V/V）抽提，12000r/min离心10min，重复抽提3次，上清转移到新的无菌离心管中；加入50μL3mol/L的NaAc，300 μL异丙醇沉淀1 h，4℃、12 000 r/min离心20 min，弃上清；加入预冷的500 μL体积分数为70%的乙醇洗涤，于4℃、12 000 r/min离心20 min，弃上清，挥发1～3h；待乙醇完全挥发后，加入50 μL 1×TE溶解，于4℃保存。

1.3.3细菌16S rDNA基因PCR扩增[15]

引物扩增细菌16S rDNA V3区。第一轮采用引物338f和518r，将DNA模板稀释10倍后进行扩增，第二轮再将PCR一轮产物作为模板，采用引物338fgc和518r进行扩增。PCR反应体系（30 μL）：ddH2O 13.4 μL，PremixTaqTM15 μL，引物（10 μmol/mL）各0.3 μL，模板DNA 1 μL。PCR反应程序：92℃预变性2 min；92℃变性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸6 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.4扩增产物的变性梯度凝胶电泳

对PCR第二轮产物进行变性梯度凝胶电泳实验。丙烯酰胺凝胶浓度为8%，变性范围40%～60%。使用1×TAE缓冲液，50 V预跑30 min，再以180 V电泳7 h，银染法染色，数码相机拍照。采用Quantity One软件对DGGE图谱进行分析，采用UPGMA算法对图谱进行聚类分析，生成样品系统发育树，得出群落结构相似性指数（Sc）；测定图谱条带光强度，计算出多样性指数（H）。

式中：Ni为DGGE图谱中条带i的光强度；N为所有条带的光强度之和；Pi为某一条带的强度与同泳道中所有条带总强度的比值；S为每一泳道总的条带数。

2　结果与分析

2.1不同处理的窖泥复合功能菌液DGGE图谱

不同处理的窖泥复合功能菌液DGGE图谱见图1。

图1　不同处理的窖泥复合功能菌液DGGE图谱Fig.1　DGGE spectrogram of composite functional microbe fluid in pit muds with different treatment

DGGE图谱中不同位置上的条带表示不同种的细菌，而相同位置上的条带所对应的细菌可理解为同一菌种；条带的颜色深浅反应了细菌的丰度，条带颜色越深，说明该细菌的相对含量较大。由图1可知，各个泳道细菌分离程度较好，分别得到10～25条数目不等的条带。其中H1、H2是所有样品共有条带，但条带数目差异较大，说明不同处理的窖泥复合功能菌液中细菌种类差异较大。

2.2不同处理的窖泥复合功能菌液细菌群落结构相似性指数（Sc）分析

群落结构相似性指数（Sc）表示在DGGE图谱上不同样本间相同位置上的条带代表相同物种，相同物种的条带数量反应了样本间菌群种类的相似程度，相似性指数（Sc）越小，表明样本间群落结构差异越大。不同处理的窖泥复合功能菌液细菌群落结构相似性指数（Sc）结果见图2。由图2可知，窖泥复合功能菌液可分为2个大族，E1、F3、F2、C2、C3、E3、E2为第一族，其余样品为第二族。其中处理C、处理E和处理F主要在第一族，而处理A在第二族，且两个族的相似性指数（Sc）为0.34，表明处理C、处理E、处理F与处理A中细菌种类差异较大，说明了窖泥复合功能菌液中酒糟、己酸菌和黄水对该体系中细菌群落结构的组成贡献较大。第二族中处理D与处理A相似性指数（Sc）为0.43，表明窖泥对该体系中细菌群落结构的组成具有一定的影响；处理B与处理A相似性指数（Sc）为0.56，表明大曲粉对窖泥复合功能菌液中细菌群落结构的组成影响不显著。

图2　不同处理的窖泥复合功能菌液细菌群落结构相似性树状图Fig.2　Dendrogram of bacterial diversity similarity of composite functional microbe fluid in pit muds with different treatment

2.3不同处理的窖泥复合功能菌液多样性指数（H）分析

图3　不同处理的窖泥复合功能菌液细菌多样性指数(H)Fig.3　Bacterial diversity index(H)of composite functional microbe fluid in pit muds with different treatment

多样性指数（H）主要是基于物种数量反应群落种类多样性，多样性指数越高，窖泥复合功能菌液中的生物多样性就越高。不同处理的窖泥复合功能菌液多样性指数（H）结果见图3。处理A的H值与处理B、处理D、处理F的H值相近，表明处理B、处理D、处理F与处理A中细菌多样性相似（p＞0.05），说明窖泥复合功能菌液中减少曲药、窖泥和黄水对窖泥复合功能菌液中细菌多样性影响不明显；而处理C和处理E的H值显著低于处理A的H值（p＜0.05），表明处理C和处理E中细菌多样性低于处理A，说明减少酒糟和己酸菌对窖泥复合功能菌液中细菌多样性影响较大，且处理E的H值＜处理C的H值，则说明其对窖泥复合功能菌液的影响程度为己酸菌＞酒糟。己酸菌在酿酒发酵过程中产生大量的己酸，为己酸乙酯提供前体物质。DGGE图谱显示，不加己酸菌的处理多样性指数显著下降，可能是由于己酸菌的某些代谢产物为其他细菌提供了营养物质，有促进细菌生长的作用，但具体作用机理还需进一步研究。另外，酒糟是酿酒过程中微生物物质能量交换的主要载体，在发酵过程中富集很多酿酒微生物，其代谢产物易累积在酒糟中，为细菌提供营养物质，这可能是其显著提高菌液细菌多样性水平的原因之一。

3　结论

本实验利用PCR-DGGE技术分析窖泥复合功能菌液中各组分对该体系中细菌群落结构的影响。根据不同处理的窖泥复合功能菌液细菌DGGE图谱的相似性指数（Sc）和多样性指数（H）分析。结果显示，不同处理的窖泥复合功能菌液中细菌种类差异较大，其中酒糟、己酸菌和黄水对该体系中细菌群落结构的组成贡献较大；酒糟和己酸菌对窖泥复合功能菌液中细菌多样性影响较为显著（p＜0.05），且己酸菌的影响程度最高，酒糟次之。

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Analysis of bacterial diversity of composite functional microbe fluid in pit muds by DGGE

LIU Ying1,2,LIU Maoke1,2,REN Daoqun1,2,YAO Wanchun1,2,TIAN Xinhui1,2,ZHANG Xingyu1,2,TANG Yuming1,2*
(1.Biotechlogy Center,Rice＆Sorghum Research Institute,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Luzhou 646000,China; 2.Luzhou Liquor-making Science Research Institute,Luzhou 646000,China)

The effects of raw material(including pit muds,vinasse,Daqupowder,yellow water,caproic acid bacteria)of composite functional microbes fluid in pit muds on bacterial community were analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE).The results of microbial diversity similarity analysis showed that the similarity coefficient(Sc)of bacterial diversity of the microbial liquid without vinasse,caproic acid bacteria and yellow water with pit muds composite functional microbial fluid was only 0.34.The results of diversity index analysis showed that the bacterial diversity index(H)of the microbial liquid without vinasse and caproic acid bacteria was decreased significantly(p＜0.05),and the bacterial diversity index (H)of the microbial liquid without caproic acid bacteria was the most obvious decrease.The results showed that the every component in pit muds composite functional microbes fluid had certain influence on bacterial diversity,and the influence of caproic acid bacteria was the greatest.The study provided theoretical basis for the improvement and optimization of formula of composite functional microbe fluid in pit muds.

composite functional microbe fluid in pit muds;bacterial diversity;DGGE

TS261.1；TS262.3

0254-5071（2016）10-0088-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.019

2016-05-19

四川省财政创新能力提升工程项目（2016QNJJ-019）

刘颖（1991-），女，研究实习员，研究方向为酿酒功能微生物。

唐玉明（1963-），男，研究员，硕士，研究方向为发酵工程。