广东省猪圆环病毒2型基因的克隆与序列分析

严 妍，宫 婷，张守峰，赵敬慧，刘 晔，王 颖，张 菲，张锦霞，扈荣良

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118；2.军事医学科学院军事兽医研究所 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，长春130122；3.本溪市畜产品安全监察所，本溪117000）

·简报·

广东省猪圆环病毒2型基因的克隆与序列分析

严 妍1,2，宫 婷3，张守峰2，赵敬慧2，刘 晔2，王 颖2，张 菲2，张锦霞2，扈荣良2

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118；2.军事医学科学院军事兽医研究所 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，长春130122；3.本溪市畜产品安全监察所，本溪117000）

根据GenBank已发表的猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）全基因组序列，设计1对特异性引物，对广东省不同地区规模化猪场采集的临床诊断为断奶仔猪多系统消耗综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的组织病料进行了PCV2基因克隆和序列分析。结果表明，采集的PMWS病料均可扩增出PCV2完整基因序列，与GenBank已发表的PCV2参考毒株序列核苷酸同源性达93.7%～99.8%，亲缘关系密切。其中10个PCV2基因全长1767 bp，属于PCV2b亚型，1个PCV2基因全长1768 bp，属于PCV2a亚型。

猪圆环病毒2型；基因分析；流行毒株

猪圆环病毒（Porcine circovirus type 2，PCV 2）属于圆环病毒科、圆环病毒属，为已知的最小的动物病毒之一。PCV以滚环方式复制，呈20面体对称，无囊膜，直径17～22 nm，含有1.76～2.3 kb 的单链环状DNA，相对分子量58 kDa，沉降系数为52 S。根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列，将其分为PCV1和PCV2两个型。PCV1无致病性，广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系。PCV2具有致病性，主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS），临床症状为渐进性消瘦、呼吸困难急促、贫血、腹泻、黄疸、间质性肺炎、淋巴腺炎及肾炎等。PCV2在淋巴系统增殖可导致机体免疫机能下降，造成其他病毒性、细菌性疾病的并发或继发，使病情加重。此外，PCV2经常与多种病原混合感染，使疾病复杂化，给养猪业带来了巨大的经济损失。

根据基因组大小，许多学者将PCV2分为PCV2a （PCV2-2）和PCV2b（PCV2-1）两种亚型，其中PCV2a基因组全长1768 bp，报道的国家主要有中国和欧洲国家；PCV2b基因组全长1767 bp，在世界范围内普遍感染。2003年后猪群中PCV2的基因型逐渐从以PCV2a主导转变成PCV2b主导，与此同时，猪群中PCVD的发病率和严重程度也逐渐升高。

本研究采用PCR从疑似病料中克隆得到PCV2全基因，构建重组质粒，并对其序列进行分析，探索PCV2的变异规律，为该病毒的分子生物学、流行病学、致病机理等相关领域的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 阳性病料 2010～2012年在广东省不同地区发病猪场，采集临床症状疑似PMWS发病死猪内脏及淋巴结：2010年河源市1份、2012年阳江市、中山市各1份，云浮市、清远市2份，佛山市3份，共11份。

1.2 主要试剂 质粒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自爱思进生物技术有限公司；Biospin组织基因组DNA提取试剂盒购自BioFlux公司；rTaq聚合酶、pMD18-T、T4 DNA连接酶、DL2000 Marker均购自TaKaRa公司。

1.3 DNA提取 用Biospin组织基因组DNA提取试剂盒按使用说明提取病料组织总DNA，－80℃保存备用。

1.4 PCV2全基因的扩增 参考GenBank上PCV2全基因序列（GenBank登录号：HM623764.1），利用Primer Premier 5.0设计并合成针对猪圆环病毒2型全基因的引物。PCV2F：5'-GTACCTTGTTGG AGAGCGGG-3'；PCV2R：5'-TCACAGCAG TAGACAGGTCA-3'。引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。用高压灭菌超蒸水溶解配成10 pmol/μL，－20℃保存备用。50 μL反应体系：引物各1 μL（10 pmol/μL）、Premix Taq®Version2.0 （1.25 U /25 μL）25 μL、DNA模板3 μL。反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，51℃退火45 s，72℃延伸50 s，共进行35个循环。设无菌蒸馏水为阴性对照。

1.5 PCV2全长基因核苷酸序列测定 按照DNA回收试剂盒的说明对PCR产物进行回收，并将回收产物与pMD18-T连接，连接体系：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL、回收的PCR产物5 μL、pMD18-T 1 μL、T4 DNA 连接酶 0.5 μL，加水至10 μL，于16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，37℃温箱培养12～16 h后，进行菌落PCR鉴定。阳性克隆送中美泰和生物有限公司进行序列测定。

1.6 PCV2同源性对比与系统发育分析 利用DNAStar软件将测序结果同已发表的PCV2全基因核苷酸序列进行比较，确定各PCV2毒株与已发表的PCV2全基因核苷酸序列的同源性。为更好了解PCV毒株的遗传学特性及相互的亲缘关系，在分析所有毒株同源性的基础上绘制了系统发生进化树。

2 结果与讨论

2.1 PCV2 全基因组PCR结果 广东省不同地区11份疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）组织病料均克隆出PCV2基因，表明PCV2在广州省普遍流行。自2000年郎洪武等[1]首次报道PCV2在我国流行以来，全国多个地区报道有PCV2的流行。李玲等[2]检测全国12个省市不同猪群的452份样品，阳性率73.8%。崔亚兰等[3]对贵州省不同猪群的133份样品进行检测，阳性率为77.44%。吴瑗等[4]检测浙江省180份可疑病料，阳性率为41.4%。

通过扩增全基因组序列，得到的11条PCV2全基因序列中，其中10条大小为1767 bp、1条为1768 bp，序列名称如下：广东GD12-393株为PCV2a亚型，基因组为1787 bp；广东GD10-01、GD12-59、GD12-130、GD12-202、GD12-275、GD12-266、GD12-259、GD12-228、GD12-230、GD12-238株为PCV2b亚型，基因组为1767bp(见图1)。表明PCV2b为广东地区的主要流行株。PCV2分为PCV2a 和PCV2b[5-9]两种基因亚型，其中PCV2a细分为5个基因型（2A-2E），PCV2b可分为3个基因型（1A-1C）[10]。有研究表明PCV2b致病性更强[6,11-13]。李玲等[2]检测的阳性样品中克隆得到的31株毒株序列均为PCV2b。邵萌等[14]检测了2010年至2012年间陕西省141份样品，其中106例为PCV2b型感染。说明我国流行PCV2的基因型逐渐已从以PCV2a主导转变成PCV2b主导[15]并成为我国当前优势基因型毒株[12]。

图1 样品中PCV2 的PCR检测结果Fig.1 The result of PCV2 detection by PCR

2.2 同源性比对和系统进化分析 将以上得到的11株PCV2全基因核苷酸序列同GenBank中的中国大陆株（ZJ0882、JS0737、GX0841a、SH0710），台湾株（HsinChu）、新疆株（XJ0901）核苷酸序列同源性比对和建立系统发育树（见图2、3），结果显示其同源性为93.7%～99.8%。表明广东省在2010～2012 年PCV2流行毒株与全国各地区流行毒株相似，为我国普遍流行的毒株。本次对广东省PCV2流行病学情况的调查，可以为该地区PCV2的诊断、控制和预防提供科学依据。

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图2 PCV2全基因序列同源性对比（1-11为本研究测定序列）Fig.2 Genetic sequence homology based on the amino acid sequence of PCV2 ORF2 gene (The 1-11 indicates the gene segment sequenced in this study)

图3 PCV2全基因序列建立的系统发育树（粗体为本研究测定序列）Fig.3 Phylogenetic tree based on the amino acid sequence of PCV2 ORF2 gene (The bold indicates the gene segment sequenced in this study)

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CLONGING AND SEQUENCING OF PORCINE CIROVIRUS TYPE 2 IN GUANGDONG

YAN Yan1,2, GONG Ting3, ZHANG Shou-feng2, ZHAO Jing-hui2, LIU Ye2, WANG Ying2, ZHANG Fei2, ZHANG Jin-xia2, HU Rong-liang2
(1.College of Animal Science and Technology, Jilin Agriculture University, Changchun 130118, China; 2.Military Veterinary Research Institute, Academy of Military Medical Sciences, Changchun 130122, China; 3.Livestock Product Safety Supervision Institute of Benxi, Benxi 117000, China)

A pair of specific primers were designed according to the whole genomic sequence of porcine circovirus type2( PCV2 ) published on GenBank.The suspicious samples were collected from large scale pig farms in different areas of Guangdong province and examined in PCR and resulting amplicons were cloned and sequenced.The results showed that nucleotide sequences of 11 PCV2 isolates were stable and their similarities were 93.7% to 99.8% with the reference strain published in the GenBank.The complete sequences of 10 PCV2 isolates were1767 bp and belonged to PCV2b subtype.However, the complete sequence of one PCV2 isolate was 1768 bp and belonged to PCV2a subtype.

Porcine cirovirus type 2; phylogenetic analysis; epidemic strain

S852.659.2

B

1674-6422（2016）02-0076-04

2015-11-01

公益性行业（农业）科研专项（201203056）

严妍，女，硕士研究生，预防兽医学专业；宫婷，女，硕士研究生，预防兽医学专业

扈荣良，E-mail：ronglianghu@hotmail.com