双抗夹心ELISA检测兔出血症病毒抗原方法的建立及初步评估

郭慧敏，谭永贵，缪秋红，朱 杰，刘 腾，陈宗艳，李传峰，刘光清

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

·研究论文·

双抗夹心ELISA检测兔出血症病毒抗原方法的建立及初步评估

郭慧敏，谭永贵，缪秋红，朱 杰，刘 腾，陈宗艳，李传峰，刘光清

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

为建立一种快速、特异性强的用于检测兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）抗原的双抗夹心ELISA方法，本研究通过抗体配对实验，确定以抗兔出血症病毒结构蛋白VP60单克隆抗体9H9为捕获抗体，辣根过氧化物酶标记的9H9为检测抗体建立双抗夹心ELISA方法。通过优化，确定最佳条件为：0.5μg/mL稀释后的9H9作为捕获抗体，底物显色液37℃包被2 h 4℃过夜，1%明胶溶液37℃封闭2 h，用含10%胎牛血清的PBST按5 μg/mL稀释后的辣根过氧化物酶标记的9H9作为检测抗体，37℃作用15 min。建立的ELISA方法与杯状病毒科其他病毒无交叉反应，应用本方法和RT-PCR方法对85份兔肝脏样品进行检测，证明双抗夹心ELISA方法具有良好的特异性和敏感性，有望作为临床快速检测的一种简便方法。

兔出血症病毒；单克隆抗体；双抗夹心ELISA

兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）感染兔引起的一种急性、烈性、高度致死性传染病[1]。1984年，RHD在我国首次爆发[2]，随后欧洲、美洲等地都有该病爆发的报道。RHDV主要侵染2月龄以上的青年兔和成年兔，具有潜伏期短、感染率高和死亡率高等特点。RHDV感染对世界范围内的养兔业都造成了极大的损失。

当前，国内针对兔病毒性出血症的临床诊断方法主要分为两类：一类是血清学方法，主要是采用人的“O”型红细胞进行的红细胞凝集试验、血凝抑制试验以及间接ELISA等方法[1,3]，但由于感染兔组织和血清样品中有时含毒量低或抗体水平较低，常常不足以产生血凝现象，容易造成敏感性和检测准确率较低的问题。另一类是针对病毒基因的检测，主要是RT-PCR和qRT-PCR方法等，这类方法操作简便，检测率高，但由于需要专门的PCR仪器等特殊仪器，需要专业人员操作，一定程度上限制了基层和大量临床样本的检测工作的开展。针对以上问题，有必要建立一种快速简便而且敏感特异的针对RHDV抗原的诊断方法。

双抗夹心ELISA检测方法由于其高效、敏感、特异性，而且操作简单、适宜于基层和大批样品检测等特点，已经成为国内外动物疫病常用的疾病诊断技术。VP60蛋白是RHDV的主要结构蛋白，也是病毒的主要免疫保护性抗原，因此常作为RHDV诊断的诊断抗原[4-6]。前期本实验室已经成功筛选出7株抗VP60蛋白的杂交瘤细胞并制备腹水以及进行了酶标。本研究通过对7株单抗进行抗体配对实验，筛选出诊断效果最好的单抗作为捕获抗体和检测抗体，并建立一个检测RHDV抗原的双抗夹心ELISA方法。检测。

1.2 试剂 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司；BSA、脱脂乳和明胶购自上海生工公司；96孔酶标板购自美国Corning公司；底物显色液购自上海碧云天生物公司；包被液（pH9.6，0.05%mol/L碳酸盐缓冲液）、PBST（pH7.4，含0.05%Tween20），终止液（2 mol/L H2SO4）均由本实验室自行配制。

1.3 样品的处理 将兔肝脏用PBS按10 mL/g进行充分研磨，10 000×g离心10 min后取上层液体并按40 mL/g定容保存。

1.4 抗体配对实验 为了确定捕获抗体和检测抗体的最佳组合，将7株单抗和所对应的酶标单抗进行逐一配对。将7株单克隆抗体进行梯度稀释后按100μL/ 孔 包被酶标板，4℃作用2 h，PBST洗3次，每次5 min；然后按200 μL/孔加入1%BSA，37℃封闭2 h，PBST洗3次，每次5 min；加入兔出血症病毒阳性肝脏研磨液和阴性肝脏研磨液，每孔10 0 μL，37℃作用1 h，用PBST洗3次，每次5 min；加入梯度稀释后的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，每孔100 μL，37℃作用1 h，用PBST洗3次；按100μL/孔加入底物显色液并置于37℃避光作用15 min；每孔加入50 μL 2 mol/L硫酸溶液终止反应，用酶标仪测定450 nm处的吸光度（OD值）。

1 材料和方法

1.1 抗体及样品 7株抗兔出血症病毒结构蛋白VP60单克隆抗体以及所对应的酶标抗体由本实验室制备；兔出血症病毒阳性肝脏和阴性肝脏由本实验室保存；兔肝脏采集至山东省、江苏省各兔养殖场。欧洲野兔综合征病毒（Europen brown hare syndrome virus，EBHSV）样品、猫杯状病毒（Feline calicivirus，FCV）阳性样品和RHDV阴性样品进行

1.5 确定捕获抗体和检测抗体最佳工作浓度 按照上文中抗体配对实验的基本试验程序，采用棋盘法，用包被液将9H9单克隆抗体按40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/mL倍比稀释，将兔阳性肝脏按1:40研磨，用PBST将2 mg/mL的酶标单抗9H9进行1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16 000稀释，最后那个酶标仪测出450nm波长下OD值。根据判定阴性（P）值最接近于1.0时，阴性（N）值＜0.2时，为最佳工作浓度。

1.6 确定最适包被条件 用确定好的捕获抗体和检测抗体的最佳工作浓度，分别在37℃包被1 h，37℃包被2 h，4℃包被2 h，37℃包被2 h后4℃过夜，进行ELISA试验，根据P/N值确定最适包被 条件。

1.7 确定最佳封闭剂 在已确定的最佳作用条件下，分别用5%脱脂乳、1%BSA、1%明胶、1%FBS作为封闭剂，37℃封闭2 h进行ELISA，根据P/N值确定最佳封闭剂。

1.8 确定最佳封闭条件 在已确定的最佳作用条件下，分别4℃过夜、37℃1 h、37℃2 h、37℃3 h进行封闭，根据P/N值确定最佳封闭条件。

1.9 确定最佳酶标抗体稀释液 分别用PBS、PBST、含1%BSA的PBS、含1%BSA的PBST、含10%FBS的PBS和含10%BSA的PBST作为酶标抗 体稀释液进行ELISA试验，其他条件为上述最佳条件，根据P/N值确定最佳酶标抗体稀释液。

1.10 确定阴阳性标准 使用确定的最适条件对36份用间接ELISA方法和RT-PCR方法检测确定RHDV阴性的SPF兔肝脏进行双抗夹心ELISA检测，计算其平均值（x）和标准差（s），并确定检测临界 值。

1.11 特异性试验 利用该已确立的方法检测RHDV阳性样品。

1.12 临床样品检测试验 用建立的双抗夹心ELISA法对山东省和江苏省各兔场采集的85份兔肝脏样品检测，同时用RT-PCR方法进行检测[7]，比较两种方法的敏感性、特异性和符合率。

2 结果

2.1 抗体配对试验 采用7株单抗与所对应的辣根过氧化物酶标记的单抗分别作为捕获抗体和检测抗体进行逐一配对，结果显示9H9作为捕获抗体，HRP-9H9作为检测抗体，其检测效果最好。结果详见表1。

表1 7株单克隆抗体与HRP-9H9单克隆抗体配对结果Table1 The pairing result of 7 monoclonal antibodies and HRP-9H9

2.2 双抗夹心ELISA法的建立与优化 采用棋盘法测定各孔OD值。结果显示，终浓度为0.5 μg/mL和5 μg/mL分别为捕获抗体和检测抗体的最适浓度；最适包被条件为37℃包被2 h后4℃过夜；最佳封闭剂为1%明胶；最佳封闭条件为37℃、2 h；最佳酶标抗体稀释液为含10%BSA的PBST。结果详见表2、3、4、5。

表2 最适包被条件的确定Table2 Determination of optimal reaction condition for coating

表3 最适封闭剂的确定Table3 Determination of optimal blocking agent

表4 最适封闭条件的确定Table4 Determination of optimal reaction condition for blocking

表5 最适酶标抗体稀释液的确定Table5 Determination of optimal diluent for HRP-labelled 9H9 monoclonal antibody

2.3 临界值的确定 准备36份用间接ELISA和RT-PCR鉴定为RHDV阴性的SPF兔肝脏，用已确定的最适条件进行双抗夹心ELISA检测，初步确定判断标准。经计算，36份阴性血清求得平均值（x）为0.275，标准偏差（s）为0.033。根据统计学原理，确定阴阳性临界值为CP=x+3s=0.374，CN=x+2s=0.341，即待检样品的检测值≥0.374为阳性，小于0.341为阴性，介于两者之间为可疑。

2.4 试验的特异性 用已建立的双抗夹心ELISA方法对兔出血症病毒（RHDV）阳性样品，欧洲野兔综合征病毒（EBHSV）阳性样品，猫杯状病毒（FCV）阳性样品和兔出血症病毒阴性样品（N）进行检测。结果显示，除了兔出血症病毒阳性样品检测为阳性外，其余样品检测均为阴性，无交叉反应，特异性好。结果见图1。

图1 相关病毒的特异性检测结果Fig.1 Specifi city identifi cation of DAS-ELISA for RHDV

2.5 临床样品检测结果分析 用已建立的双抗夹心ELISA方法对来自山东省和江苏省各兔场的85份兔肝脏样品进行检测，检测结果为阳性19份，阴性66份。同时RT-PCR方法检测结果为阳性20份，阴性为65份，结果见表6

DAS-ELISA阳性DAS-ELISA(+) DAS-ELISA阴性DAS-ELISA(-)总数Total RT-PCR(+) 19 1 20 RT-PCR(-) 0 65 65总计数 19 66 85相对敏感性 100%相对特异性 98.5%总符合率 98.8%

3 讨论

目前RHDV的诊断方法主要是血清学检测和RT-PCR等检测方法，血清学检测方法一般比较费时费力，主观性强，准确率较低。针对检测抗体水平的间接ELISA方法，或者以病毒作为包被抗原，或者以重组VP60蛋白作为抗原。由于RHDV不能在细胞上传代，病毒增殖只能通过感染实验动物获得，病毒的增殖和纯化操作复杂，而且成本较高，不稳定，而重组蛋白往往是以包涵体的形式表达，表达纯化都不稳定，抗原性差，因此，尽管之前也有针对RHDV特异性抗体的间接ELISA诊断试剂盒的报道[8-10]，但市场上稳定高效简便的商品化检测试剂盒仍然较少。另外受感染兔有时表现耐受免疫，体内抗体滴度低等现象。因此，针对抗原检测的诊断方法更具有实际意义。而RT-PCR等基因检测方法准确率高，但需要PCR仪器，适合实验室检测，并不适合基层中大量样品的检测，而且很容易出现假阳性[11]。目前双抗夹心ELISA已应用于牛病毒性腹泻病毒[12]，甲型H1N1猪流感病毒等多种病原的检测[13]。

本研究通过对7株单克隆抗体及酶标单克隆抗体进行抗体配对，采用了9H9单克隆抗体和HRP-9H9单克隆抗体分别作为捕获抗体包被96孔酶标板和检测抗体，建立双抗夹心ELISA极大地提高了检测方法的特异性和敏感性。

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DEVELOPMENT AND PRELIMINARY EVALUATION OF A DOUBLE ANTIBODY SANDWICH ELISA FOR DETECTING RABBIT HEMORRHAGIC DISEASE VIRUS ANTIGENS

GUO Hui-min, TAN Yong-gui, MIAO Qiu-hong, ZHU Jie, LIU Teng, CHEN Zong-yan, LI Chuan-feng, LIU Guang-qing
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

In this study, a rapid, specifi c double antibody sandwich ELISA (DAS-ELISA) method for detection of Rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) was developed.By using the pairing of monoclonal antibodies, it was confi rmed that the method was developed using anti-VP60 monoclonal antibody 9H9 as capturing antibody and HRP-9H9 as detection antibody.The results showed that the optimal concentration of 9H9 was 0.5 μg/mL.The optimal concentration of HRP-9H9 was 5 μg/mL.The optimum condition of coating was 37℃and then 4℃ overnight.The optimal blocking condition was PBST containing 1% gelatin and incubation at 37℃ for 2 h.The best diluent of detecting antibodies was PBST containing 10%FBS.The ELISA method had no cross-reactivity with other caliciviruses.In clinical tests, 85 samples isolated from rabbits were subjected to DAS-ELISA and RT-PCR.The results show that the DAS-ELISA method had a high level of specifi city and sensibility could be used for rapid detection of RHD.

Rabbit hemorrhagic disease virus; monoclonal antibody; DAS-ELISA

S852.659.1

A

1674-6422（2016）02-0020-05

2016-01-18

公益性农业科研专项（201303046）；上海市科委创新项目（13391901602）

郭慧敏，男，硕士研究生，兽医学专业

刘光清，E-mail：liugq@shvri.ac.cn