大肠杆菌O-抗原血清型鉴定研究进展

刘璨颖，张济培，王丙云



大肠杆菌O-抗原血清型鉴定研究进展

刘璨颖，张济培，王丙云

大肠杆菌在一定条件下能引发宿主疾病，其表面O-抗原与毒力有关。O-抗原的化学组成和结构具有高度多样性，并且O-抗原血清型种类与大肠杆菌致病性有一定联系。因此，大肠杆菌O-抗原血清型鉴定对流行病学调查，防御和控制致病性大肠杆菌病有重要意义。传统的血清学分型方法耗时长、费用高、准确度不理想。随着科学技术的发展，研究者对大肠杆菌196种O-抗原基因簇进行了破译，比较分析了不同O-抗原基因簇序列，并针对基因簇中特异性DNA序列设计分子标记，运用PCR方法对O-抗原血清型进行分型，其中包括一般PCR、多重PCR、实时PCR、DNA芯片和微球悬浮列阵法。此外，还有rbf-限制性片段长度多态性分析法，磁性微球免疫分析法和基于全基因组序列预测法，这些方法丰富了O-抗原血清型鉴定方法，弥补了传统血清学分型方法的不足。本文概述了O-抗原合成基因簇序列和O-抗原血清型鉴定方法相关研究进展。

大肠杆菌；O-抗原；血清型分型

大肠杆菌广泛存在于自然界中，致病性大肠杆菌是一类重要的人兽共患病病原菌，依据致病特性分为肠内致病性和肠外致病性大肠杆菌。肠内致病性大肠杆菌能分泌毒素，引发宿主水样、血样腹泻，甚至导致全身性临床症状，如溶血尿毒症和肾神经后遗症。肠外致病性大肠杆菌能侵袭并定殖于宿主胃肠道外组织，并诱发感染，包括脑膜炎、败血症、泌尿道感染和呼吸道感染等。大肠杆菌菌株间差异大，常按照种系发育群、生物表型、致病特性、抗原特性等进行分类区分[1-2]。

菌体O-抗原，表面K-抗原和鞭毛H-抗原是大肠杆菌分型的主要表面抗原[3]。O-抗原是大肠杆菌脂多糖的最外层结构，与细菌对环境的适应性有关，是细菌的毒力因子，也是细菌噬菌体和宿主免疫系统的主要目标，能在宿主体内诱发强烈的免疫反应[4-6]。Ørskov于1977年提出了综合分型方案，将大肠杆菌O-抗原分为164种，该方案是分类学、流行病学调查、疾病暴发时菌株区分以及监控中大肠杆菌分型的主要标准[7]。随着研究成果的不断更新，报道有O1-O187血清型，其中6种O-抗原血清型O31、O47、O67、O72、O94和O122被撤消，4种被分为亚型O18ab/ac，O28ab/ac，O112ab/ac和O125ab/ac。此外，还有11种OX-型。因此目前大肠杆菌O-抗原血清型共有196种[8]。

O-抗原血清型种类与大肠杆菌的致病性有一定的联系，不同致病型大肠杆菌的优势O-抗原血清型不同。例如，肠出血性大肠杆菌的主要血清型为O157，E.coliO157菌株是重要的全球食源性病原菌[9]；禽致病性大肠杆菌的优势血清型为O1、O2、O18和O78[10]；与尿道感染有关的大肠杆菌，其血清型主要为O1、O2、O4、O6、O7、O16、O18、O25和O75[11]；能引发新生儿脑膜炎的肠外致病性大肠杆菌菌株，其血清型主要为O18∶K1[12]；我国患病猪场分离的猪源肠外致病性大肠杆菌菌株优势血清型依次为O11、O8、O138、O161和O101[13]。因此，快速、准确鉴定大肠杆菌O-抗原血清型将有助于流行病学调查，疾病诊断和疫苗研发，对防御并控制致病性大肠杆菌传播有重要意义。

1 O-抗原概述

1.1 O-抗原组成和特性 革兰氏阴性菌外膜脂多糖由脂质A，核心寡糖和O-抗原多糖3部分组成。脂质A在大肠杆菌中非常保守，是毒性成分。核心寡糖区域分为内部和外部区域，O-抗原多糖与核心寡糖外部区域的糖基相连，具有血清型特异性，由含有3-7个单糖的寡糖单位重复连接组成。单糖种类、数量、排列方式和寡糖间链的不同构成了O-抗原的多样性[6,14]。基因水平转移是O抗原高度多样性的主要原因。基因水平转移、重组和点突变能使O-抗原血清型发生转变[15-17]。此外，获得位于细菌噬菌体或质粒上的O-抗原修饰基因也能导致细菌O-抗原血清型的差异[18-19]。具有完整O-抗原的大肠杆菌为光滑型表型，而O-抗原发生突变或丢失时，大肠杆菌失去合成O-抗原的能力，为粗糙型表型[20]。

1.2 O-抗原合成基因簇 大肠杆菌中，大部分编码O-抗原合成酶的基因在染色体上相邻排列，形成一个约4.5 kb(O155，含有4个基因)-19.5 kb(O108，含有18个基因)的基因簇，被称为rfb基因簇。该基因簇两端常有持家基因galF(UTP-葡萄糖-1-磷酸尿甙基转化酶编码基因)和gnd(6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因)，在染色体上位于可拉酸合成基因簇(wca基因)和组氨酸(his基因)合成操纵子之间[21]。DebRoy等对大肠杆菌196种O-抗原合成基因簇进行序列分析，结果显示其中有21组(46种)序列相似性高达98%～99.9%，插入元件在O-抗原合成基因簇进化过程中发挥了重要作用[8]。但O-抗原血清型O14和O57型菌株galF和gnd基因间不含有O-抗原合成基因簇[22]。

O-抗原合成基因簇中主要包括3类基因：单糖合成酶基因、糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因。核苷酸糖合成基因参与O-抗原核苷酸糖前体的合成，在不同O-抗原血清型中有高度相似性，且常聚集成簇[14,8]。最新研究显示有至少27%种O-抗原血清型，核苷酸糖合成基因不位于O-抗原合成基因簇中[22]。糖基转移酶转移不同糖前体形成寡糖，每种O-抗原合成基因簇中含有2～6个基因编码假定糖基转移酶。糖基转移酶基因的点突变能导致O-抗原血清型间的差异[16]。O-抗原处理蛋白涉及O-抗原基本单位的转运和聚合。

在大肠杆菌中合成O-抗原多糖的途径为Wzy聚合酶依赖型途径和三磷酸腺苷结合转运盒(ATP-binding cassette, ABC)转运子途径。这两种合成途径中，基因wzx(糖基转移酶编码基因)/wzy(寡糖单位聚合酶编码基因)和wzm(O-抗原ABC转运子通透酶编码基因)/wzt(ABC转运子ATP-结合蛋白编码基因)分别与O-抗原基本单元转运和聚合有关。DebRoy等对大肠杆菌196种O-抗原合成基因簇进行分析，显示185种基因簇中含有wzx和wzy基因，这两个基因与运用Wzy聚合酶依赖型途径合成和转运O-抗原有关，另外11种O-抗原血清型(O162，O101，O89，O92，O97，O52，O95，O60，O8，O99和O9)携带wzm和wzt基因，利用三磷酸腺苷结合转运盒转运子途径处理O-抗原。并且依据Lguchi等对大肠杆菌182种O-抗原合成基因簇wzx/wzy或wzm/wzt同源基因序列分析结果显示，137种O-抗原合成基因簇wzx/wzy或8种O-抗原合成基因簇wzm/wzt同源基因序列差异大，同源性<70%，具有一定的O-抗原合成基因簇特异性[8,22]。

2 O-抗原血清型分型方法

2.1 传统血清学分型方法 传统的O-抗原血清型鉴定方法是运用特异的抗血清进行血清凝集实验，需要从检测样品中分离出细菌并进行富集，将细菌于100 ℃加热2 h释放出表面O-抗原后，与标准O-抗原血清型细菌的特异性抗血清进行血清凝集反应，眼观判断实验结果。若菌体表面无脂多糖呈粗糙型，或者菌体发生自凝集，则不与抗血清发生凝集反应，不能用该方法进行鉴定。如O14型菌株为粗糙型表型，与抗血清不反应，不能进行血清学分型。此外血清学鉴定方法还受到血清质量、血清来源、血清交叉反应、以及菌体表面其他抗原成分的影响，使检测准确度、检出率和灵敏度不太理想[8, 23]。并且传统的血清学分型方法耗时长，花费高，不利于大规模检测。

2.2 基于特异性DNA序列的PCR分型方法 基于特异性DNA片段的PCR鉴定方法可以实现对生物样品快速、准确和高效的检测，能够很大程度上弥补传统血清学鉴定方法的不足。基因wzx/wzy或wzm/wzt具有一定的O-抗原血清型特异性，常被作为PCR和芯片分析鉴定大肠杆菌O抗原血清型的靶标。依据基因wzx/wzy或wzm/wzt的特异性DNA片段，设计并筛选出不同O-抗原血清型的特异性引物，运用PCR进行大肠杆菌O-抗原血清型鉴定[24-28]。但19.8%种O-抗原血清型中wzx/wzy基因不具有特异性，或特异区域过短，无法设计引物。如O73型、O17型、O44型、O77型与O106型大肠杆菌中wzx/wzy基因的核苷酸序列同源性≥95%；wzx_O46与wzx_O134基因序列同源性为99.7%，wzx_O46基因仅在3′端区域有2 bp的缺失突变[22]。也可依据rfb基因簇中差异区域DNA序列设计引物进行PCR鉴别。例如wzx/wzy-O62与wzx/wzy-O68基因的核苷酸序列同源性>97%，O62与O68型rfb基因簇序列的差异仅在于O62中含有一个748 bp的插入元件IS1，该插入元件位于rmlA基因末端。因此为了鉴定并区分大肠杆菌O62与O68型，应在扩增出相应wzx/wzy基因后，再在O62型rfb基因簇IS1元件两侧设计分子标识，依据PCR产物大小差别区分两种O-抗原血清型(表1)[27]。目前，根据已报道的文献统计，设计并筛选出特异性引物的O-抗原血清型种类有68种，DebRoy等于2011年统计了58种[29]，本文补充了10种，包括O11，O12，O23，O62，O68，O116，O131，O140，O142和O163(表1)。

表1 基于大肠杆菌O-抗原合成基因簇特异序列的PCR引物
Tab.1 PCR primers based on specific sequence of E. coli O-antigen synthesis gene cluster

O-antigenserogroupTargetPrimersequencesSizeofPCRproduct(bp)ReferenceO11wzxF:GCACGCTTACTTACAC39524R:TTCCTATTAGTACTGCTwzyF:TTTGCCTCTTGCTTTA860R:TACTGCTCCGTTCTCAO12rbfregionF:ATACCGACGACGCCGATCTG23925R:GTGTCAAATGCCTGTCACCGO23wzxF:TTTTGTTTATCTTGGGCG42326R:TTTTTTCTTATGCTGCCCwzyF:TGCATAACTCTTCAGGCG402R:GCTTGGTAAGGTACGCTGO62wzxF:ATGCTGCATTAGCGTTAGCA28827R:CCTGTTGAATTGGCACGTAArmlAF:CTACACTGATGTTAGCGGGTATT1969R:CCGCTTCAAATTCAGGACAATAAO68wzxF:ATGCTGCATTAGCGTTAGCA28827R:CCTGTTGAATTGGCACGTAArmlCF:CTACACTGATGTTAGCGGGTATT1172R:CCGCTTCAAATTCAGGACAATAA表1(续)O-antigenserogroupTargetPrimersequencesSizeofPCRproduct(bp)ReferenceO116wzxF:GTTTTGTCGGTAGTGTTAGG62828R:CAAGTTGGAGGAATAAGTCGwzyF:TGCTGCCCTGTTTCATTCT548R:CATAAAAGTCCGTAGCGTAGO131wzxF:TCGTGAGAAGGCTTTTTGGT29027R:CCCTATCCAATGCGCTTAAAO140wzxF:TTGGATAGCCGCGTTAATTC29427R:GCCTGAGTTAGCGGATTGAGO142wzxF:TCTCCATCCCCGTTTATTTG28527R:CCCCAAACATTAGCATTCGTO163wzyF:GCAATCTTGAAGCCAGAACC26227R:GATAAACCCAGCCACCAAA

针对O-抗原合成基因簇特异性序列设计引物进行一般PCR、多重PCR和实时PCR鉴定O-抗原血清型外[30-31]，目前还延伸至DNA芯片法和微球悬浮列阵法。

DNA芯片法是将待检大肠杆菌O-抗原合成基因簇中基因的PCR产物或寡聚核苷酸点在玻璃片上，然后与带有标签的特异O-抗原合成基因簇长片段PCR产物进行杂交，依据杂交信号判断并鉴定大肠杆菌O-抗原血清型种类。DNA芯片法已用于肠产毒素大肠杆菌O-抗原血清型分型[33]。DNA芯片法优势在于能在同一平台上一次性鉴定多种O-抗原血清型。

磁性微球悬浮列阵法中，微球外部结合有O-抗原血清型特异性DNA序列探针，微球内部染有不同比例红色和红外荧光，可以产生100种独特的光谱，因此每个样本理论上可以分析高达100种不同的结合反应。悬浮列阵由独特荧光微球组成。该方法，首先提取样品DNA为模板，用生物素标记的多种O-抗原血清型检测引物进行多重PCR扩增，将PCR反应产物变性后与微球上带有的特异性探针进行杂交反应，再用偶联有强荧光藻类色素R藻红蛋白的链霉素进行显色检测[34]。Lin等用该方法检测了10种与产志贺氏毒素大肠杆菌相关的O-抗原血清型[35]。

2.3 rbf-限制性片段长度多态性分析法 rbf-限制性片段长度多态性分析法是利用长片段PCR方法扩增出待检大肠杆菌整个rfb基因簇后，用限制性内切酶MboII对PCR产物进行酶切，通过酶切后DNA片段凝胶电泳图谱鉴定大肠杆菌O-抗原血清型。图谱中条带数目为5到25条，共有147种不同O-抗原限制性片段长度多态性图谱。但其中有13种图谱分别对应两种以上O-抗原血清型[36]。此外，由于图谱中条带较多，不易区分，且同一条带中可能含有多条相同大小的酶切片段，结果分析易受干扰，且该分析方法耗时较长，使得rbf-限制性片段长度多态性分析法有一定的限制性。

2.4 磁性微球免疫分析法 磁性微球免疫分析法，与上述微球悬浮列阵法都是使用Luminex技术，是一种复合微球感应系统。采用该技术的分析，用微球表面共价固定的特异O-抗原血清型单克隆抗体来捕获抗原。通过带有生物素的二抗和红藻蛋白报告子检测到结合分析物。Luminex分析仪对结合分析物进行量化，从而进行多重检测分析。微球免疫分析法的优势是可以同时进行多重分析，因此能够降低检测的费用，并且检测时间较短，只需要3 h，此外该方法具有高灵敏度和特异性。Clotilde等利用该方法同时检测了产志贺氏毒素大肠杆菌O-抗原血清型O157、志贺氏毒素1和2，并且证实与标准的酶联免疫吸附实验相比，该方法有上述优势[37]。

2.5 基于全基因组序列预测法 SerotypeFinder在线预测工具通过收集已知O-抗原血清型大肠杆菌菌株中wzx/wzy或wzm/wzt基因序列建立数据库，将待测大肠杆菌菌株的全基因组草图或完整序列与数据库中序列进行BLAST比对，利用序列相似性来预测待测大肠杆菌菌株的O-抗原血清型。该方法相比于传统血清学方法更为高效，但对于不同O-抗原血清型大肠杆菌中wzx/wzy或wzm/wzt基因有高度同源性时，鉴定结果不理想，且比对wzx或wzy基因可能有鉴定结果不一致的情况[38]。

3 结 语

大肠杆菌O-抗原血清型种类繁多，而血清型种类与大肠杆菌致病型有一定的联系。因此，实现大规模准确、快速、便捷鉴定O-抗原血清型将有助于流行病学调查，疾病诊断和疫苗研发，对防御并控制致病性大肠杆菌传播有重要意义。随着越来越多大肠杆菌基因组序列的公布和O-抗原合成基因簇的破译，可以基于DNA序列，利用现代分子生物学方法弥补传统血清学方法的不足，不断完善O-抗原血清型鉴定方法。

目前已破译196种O-抗原合成基因簇，但其中只有68种设计并筛选出了特异性分子标识。除去O-抗原合成基因簇序列同源性>98%的21组血清型(共46种)，还有82种O-抗原血清型特异性分子标识有待确定。O-抗原合成基因簇序列高度相似的这21组血清型(46种)中，有4组(8种)不发生血清学交叉反应，包括O2型和O50型，O46型和O134型，O118型和O151型，OX19型和O11型，可以联合现代分子生物学和传统血清学方法进行O-抗原血清型鉴定。O-抗原合成基因簇序列高度相似的O-抗原血清型并不发生血清学交叉反应，可能是因为抗原决定簇相关蛋白在翻译后期进行了不同的修饰，也可能是与O-抗原免疫学反应有关的基因位于基因组中O-抗原合成基因簇以外的位置。对于不同O-抗原血清型大肠杆菌中O-抗原合成基因簇序列同源性>98%，并且传统血清学鉴定又出现交叉反应时，应将这些O-抗原血清型进行融合，以免影响鉴定，包括O42型与O28ac型，O13型、O129型与O135型，O107型与O117型，O123型与O186型，O125ab型与O125ac型，O18ab型与O18ac型，OX6型与O168型，OX10型和O159型，OX21型和O163型，O38型和O128型，OX43型和O19型[8]。

大规模O-抗原血清型鉴定方法，如DNA芯片法，磁性微球悬浮列阵法，磁性微球免疫分析法和基于全基因组序列预测法等，提高了O-抗原血清型鉴定的效率和准确度，将是今后血清型鉴定发展的方向。

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Research progress on identification ofEscherichiacoliO-antigen serogroups

LIU Can-ying, ZHANG Ji-pei, WANG Bing-yun

(DepartmentofVeterinaryMedicine,CollegeofLifeScience,FoshanUniversity,Foshan528231,China)

Escherichiacolicould cause diseases under certain conditions, O-antigens contribute to the virulence ofE.coli. The chemical composition and structure of O-antigen on the surface ofE.colihave high diversity, while specific O-antigen serotype have some connections with certain pathogenicity ofE.coli. Thus, identification of O-antigen serotypes is important for epidemiological studies and control of diseases caused by pathogenicE.coli. The traditional serological typing method is time-consuming, expensive and inaccurate. With the development of science and technology, 196 O-antigen synthesis gene clusters ofE.coliwere sequenced, different O-antigen synthesis gene clusters were compared and analyzed, and molecular markers for specific DNA sequences were designed. PCR method was applied for serotyping O-antigens, including single PCR, multiple PCR, real-time PCR, DNA microarray and microbead-based suspension array. Besides, restriction of the amplified O-antigen gene cluster, microbead-based immunoassay and whole genome sequencing were also used for serotyping O-antigens. These methods would enrich the identification method ofE.coliO-antigen serogroups and make up the deficiency of traditional serological typing method. This review focuses on the research progress about O-antigen synthesis gene cluster and O-antigen serotype identification methods.

Escherichiacoli; O-antigen; serotype

Wang Bing-yun, Email: bywang63@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.015

王丙云，Email: bywang63@163.com

佛山科学技术学院，佛山 528231

Q939

A

1002-2694(2016)10-0928-06

2016-04-28；

2016-08-12

广东普通高校青年创新人才项目(No.2015KQNCX173)

Supported by the project of the Young Creative Talents in Universities in Guangdong Province (No. 2015KQNCX173)