基于OMP18的B细胞抗原表位的空肠弯曲菌ELISA检测方法的建立

楼宏强，高素华，李旭升，陈浩浩，胡 野



基于OMP18的B细胞抗原表位的空肠弯曲菌ELISA检测方法的建立

楼宏强，高素华，李旭升，陈浩浩，胡 野

目的 以OMP18的B细胞抗原表位多肽为包被抗原，建立检测空肠弯曲菌感染的ELISA方法。方法 以不同浓度梯度(0.1，1，10 μg/mL)OMP18的B细胞抗原表位多肽进行包被，以空肠弯曲菌全菌兔抗IgG为一抗，HRP标记的羊抗兔抗体IgG为二抗，检测对原浓度1 mg/mL的不同稀释度(1∶10，1∶100，1∶1 000)抗体IgG水平。分别以空肠弯曲菌感染兔血清、健康兔血清及沙门菌感染兔血清为一抗，1∶3 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，比较各抗原表位多肽的免疫特异性。结果 OMP18的B细胞抗原3个表位多肽在稀释度在1∶1 000、1∶4 000、1∶16 000、1∶64 000时免疫反应性均有明显增高。其中稀释度在1∶1 000时增高最明显。OMP18的B细胞抗原表位多肽具有免疫特异性。结论 用OMP18的B细胞抗原表位多肽作为包被抗原对空肠弯曲菌感染的血清进行ELISA检测，免疫反应性高，具有免疫特异性。

空肠弯曲菌；外膜蛋白OMP18；抗原表位；酶联免疫吸附实验

空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)是常见的人畜共患病病原菌，也是一种食物源性病原菌，可在人和动物引起多种疾病，被认为是人类细菌性腹泻的主要致病菌。空肠弯曲菌为革兰氏阴性杆菌，嗜热，微需氧，培养条件苛刻，在富营养、微需氧的环境下才能生长。其主要传染源为动物或动物产品，广泛分布于各种动物体内，以禽畜、宠物为常见宿主，因此研究快速而特异的分离和检测方法具有重要的现实意义。我们前期从生物信息学角度了解空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的跨膜结构、B细胞抗原表位及其抗原性、基因序列保守性等特征[1]。本研究以OMP18优势B细胞抗原表位多肽序列为依据，合成多肽进行抗原表位的免疫学检测，并建立相关的ELLISA检测方法，为空肠弯曲菌的检测和疫苗研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 OMP18的B细胞抗原表位多肽由上海紫域生物科技有限公司合成。采用固相多肽合成技术，以N-α-Fmoc保护的氨基酸为原料，Fmoc-AA-Wang树脂为载体，HBTU方法偶联。经HPLC鉴定纯度在95%以上，相关检测方法已申请专利[2]。空肠弯曲菌OMP18的B细胞抗原具有3个表位，A抗原表位肽序列为STKSTSVSGDSSVDSNRGSGGSDGWDID，B抗原表位肽序列为EGNCDEWGTDEYN，C抗原表位肽序列为SYGETNPVCTEKTKACDAQNRR。包被液为0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6；洗涤液为0.02 mol/LTrisHCl-Tween20，pH7.4；抗体稀释液为0.05 mol/LPBS-Tween20，pH 7.4；封闭液为10 g/L牛血清白蛋白(BSA)；终止液为2 mol/L H2SO4；HRP标记的羊抗人IgG。均购自杭州泽衡生物科技有限公司。

1.2 抗原包被 用包被液将包被抗原稀释成2.5、5、10、15、20 μg/mL，包被ELISA板每孔加入100 μL，于4 ℃过夜；洗涤4次并空干后，每孔加入封闭液300 μL，4℃封闭过夜；共洗涤4次，密封后4℃保存备用。

1.3 免疫反应性测定 96孔酶标板阶梯浓度(1∶1 000，1∶4 000，1∶16 000，1∶64 000)每孔加入各抗原表位肽各50 μL，4 ℃包被过夜，各抗原表位肽样本均重复3孔。次日用含0.05%Tween20的PBS洗涤3次，然后用5%小牛血清4 ℃封闭过夜。以1∶3 000稀释的兔抗CJ为一抗、1∶10 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，TMB为底物，采用ELISA检测各抗原表位肽的免疫反应性。实验中分别设置等量BSA为包被抗原的阴性对照，以OMP18蛋白为包被抗原的阳性对照，以阴性对照样本OD值+3SD作为阳性判断标准。

1.5 重复性实验 3个表位均采用上述同样方法进行重复测定，以检测PN值。

2 结 果

2.1 OMP18的B细胞抗原表位多肽血清最佳稀释度 ELISA检测结果显示，OMP18的B细胞抗原3个表位多肽在稀释度在1∶1 000、1∶4 000、1∶16 000、1∶64 000时免疫反应性均有明显增高。其中稀释度在1∶1 000时增高最明显，A抗原表位肽OD值为2.791，B抗原表位肽OD值为2.601，C抗原表位肽OD值为2.876。见图1。

图1 3个表位梯度浓度ELISA检测兔空肠弯曲菌全血抗体的结果Fig.1 Detection of rabbit’s blood antibody against Campylobacter jejuni of 3 epitopes with gradient concentrations by ELISA

2.2 OMP18的B细胞抗原表位多肽免疫特异性

采用ELISA检测各抗原表位肽的免疫特异性结果提示，空肠弯曲菌感染兔血清免疫反应性高，A抗原表位肽OD值为1.076，B抗原表位肽OD值为0.921，C抗原表位肽OD值为0.998。健康兔血清，大肠埃希菌、痢疾志贺菌及伤寒沙门菌感染兔血清免疫反应性低，与空肠弯曲菌感染兔血清相比，均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

1.Serum from a rabbit infected with Campylobacter jejuni; 2.Serum from a healthy rabbit;3.Serum from a rabbit infected with Escherichia coli;4.Serum from a rabbit infected with Shigella dysenteriae; 5.Serum from a rabbit infected with Salmonella typhi.图2 3个表位免疫特异性ELISA检测结果Fig.2 Detection of immunological of 3 epitopes by ELISA

2.3 重复性实验 根据重复性实验测定的PN值，进行统计学处理，t值为1.70，P>0.05，表明差异无统计学意义，说明此实验有较好的重复性。

3 讨 论

空肠弯曲菌是重要的食源性致病菌，也是引起人类腹泻的主要致病菌之一，可通过食物链传染给人，引起人的急性肠胃炎和发热，进而可引发心内膜炎、骨髓炎、关节炎等全身性疾病。在病原体致病过程中，外膜蛋白在免疫反应中表现出重要作用，其通过增强巨噬细胞摄取抗原能力，促进了淋巴细胞活化，并广泛作为病原体感染的检测及保护性疫苗抗原筛选[3]。OMP18是空肠弯曲菌主要外膜蛋白，分子质量为18 kD，由OMPl8基因编码。由于在弯曲菌属中普遍存在，因此OMP18是血清学检测空肠弯曲菌感染的重要候选抗原[4]。前期我们使用TMHMM Server V2.0, DNA Star,NCBI/Blast等生物信息分析软件分析了空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的结构和分子特征，并对运用ELISA鉴定了其中可能存在的线性B细胞表位[1]。空肠弯曲菌OMP18无跨膜结构存在，全部定位于细菌表面。域预测蛋白功能结构表明OMP18中存在OMP A结构域，并与空肠弯曲菌的粘附能力密切相关。二级结构分析结果显示，在OMP18蛋白中有3个线性B细胞表位，其具有良好的抗原性和亲水性。应用空肠弯曲菌全菌抗体对预测表位进行ELISA鉴定结果显示3个表位多肽均能与全菌抗体有效结合，但结合力并不一致。

空肠弯曲菌体外培养困难，生长条件要求苛刻，常规培养方法对于快速准确的检测与鉴定有一定的难度[5]。高长航等[6]采用增菌法从180例腹泻患者粪便中检出空肠弯曲菌20株，较直接法阳性率高。增菌法的优点是：空肠弯曲菌有较好的生长能力；有较强的抑制杂菌能力，一般细菌不易生长。许旭萍[7]等用Skirrow为基础培养基，加入适量维生素B12、FeSO2和活性炭，以50%卵黄盐水替代冻溶羊血，制成改良的Skirrow培养基，容易配制，经济方便，用于空肠弯曲菌的分离和选择性增菌培养切实可行。王晓英等[8]建立了疏水栅滤膜-酶免疫方法，其对嗜热性空肠弯曲杆菌具有特异性和简单方便，目前已被用于鸡肉冲洗水和牛奶样品中空肠弯曲杆菌的检测和计数。疏水栅滤膜就是将疏水线印在膜上，从而使微生物的生长被限制在膜上的1600个方格内，增加检测和自动计数细菌的敏感性。应用特异性抗体在疏水栅滤膜上载样，进行酶免疫试验。主要步骤都在室温下进行，操作时长不足3 h，具有简单、快速、特异特点。侯建军等[9]采用VSl基因保守序列为模板，自行设计引物，扩增产物为516 bp片段。该方法只出现空肠弯曲菌扩增产物，而不出现其他弯曲菌和其他属细菌的特异性片段，检测灵敏度高达6 CFU/mL。该方法提供了一种鉴别空肠弯血菌和结肠弯曲菌的简便方法。刘光明[10]针对空肠弯曲菌马尿酸酶(hipO)基因和鞭毛蛋白A(flaA)基因设计了2组引物与荧光标记探针，初步建立了空肠弯杆曲菌的磁捕获-荧光PCR的鉴定和快速检测方法，能提高农产品及食品中空肠弯曲菌的检出率。可见，对空肠弯曲菌的检测方法已经有了初步的研究，进一步研究其毒力因子的功能、合成及致病机理，筛选具有免疫保护作用的表面抗原成分并建立快速特异的检测方法等有待进一步深入和研究。

本研究在前期采用悬浮芯片技术，筛选出3个空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18优势B细胞线性抗原表位基础上，建立了基于空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18优势B细胞线性抗原表位的ELISA方法，具有良好的重复性、特异性、敏感性特点，能应用于实验室对空肠弯曲菌的鉴别分析，对于空肠弯曲菌的检测具有一定的意义。

[1] Lou HQ, Hu Y, Wang L, et al. Analysis and identification of B cell epitopes of the OMP18 fromCampylobacterjejuni[J]. Chin J Zoonoses, 2014, 30(7): 739-742. (in Chinese)

楼宏强, 胡野, 王岚, 等. 空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的B细胞抗原表位分析及功能鉴定[J]. 中国人兽共患病学报, 2014, 30(7): 739-742.

[2] Lou HQ, Shan XY, Song CH, et al. Screening and identification of B cell epitopes method of the OMP18 fromCampylobacterjejuni[P]. Chinese patent: CN103941018A, 2014.03.27 (in Chinese)

楼宏强, 单小云, 宋春涵, 等. 一种空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的B细胞抗原表位筛选及功能鉴定方法[P]. 中国专利：CN103941018A, 2014.03.27

[3] Sizemore DR, Warner B, Lawrence J, et al. Live, attenuatedSalmonellatyphimuriumvectoring Campylobacter antigens[J]. Vaccine, 2006, 24(18): 3793-3803. DOI: 10.1016/j.vaccine.2005.07.026

[4] Qu HH, Wang J, Wang JW, et al. Research progress of pathogenic and pathogenic mechanism ofCampylobacterjejuni[J]. Prog Veter Med, 2013, 34(12): 164-169. (in Chinese)

翟海华, 王娟, 王君伟,等.空肠弯曲菌的致病性及致病机制研究进展[J].动物医学进展, 2013, 34(12): 164-169.

[5] Sandberg M, Nygard K, Meldal H, et al. Incidence trend and risk factors forCampylobacterinfections in humans in Norway[J]. BMC Pub Heal, 2006, 6(13): 1-8. DOI: 10.1186/1471-2458-6-179

[6] Gao CH, Li RB, Huang Y. Application of selective enrichment method for detection ofCampylobacterjejunifrom feces of diarrhea patients[J]. J Huaihai Med, 1997, 15(2): 28. (in Chinese)

高长航,李瑞斌,黄永.应用选择增菌法从腹泻病人粪便中检出空肠弯曲菌[J].淮海医药,1997,15(2):28.

[7] Xu XP, Li HZ. Study on the culture of theCampylobacterjejuniusing Egg Yolk Salt instead of frozen blood solution[J]. J Fujian Norm Univ, 1996, 12(4): 86-90. (in Chinese).

许旭萍, 李惠珍. 用卵黄盐水代替冻溶羊血培养空肠弯曲菌的研究[J]. 福建师范大学学报, 1996, 12(4): 86-90.

[8] Wang XY. Rapid detection and counting method ofBacilluscoliin food[J]. Fore Med Sci (Hyg), 2003, 30(3): 180-182. (in Chinese)

王晓英. 食品中空肠弯曲杆菌快速检测及计数方法[J]. 国外医学卫生学分册, 2003, 30(3): 180-182.

[9] Hou JJ, Zhu JG, Hua XG, et al. Establishment of PCR detection method forCampylobacterjejuniin animals and their products[J]. Chin J Zoonoses, 2008, 24(2): 128-131. (in Chinese)

侯建军, 朱建国, 华修国, 等. 动物及其产品中空肠弯曲菌PCR检测方法的建立[J]. 中国人兽共患病学报, 2008, 24(2): 128-131.

[10] Liu GM, Cai HN, Cao MJ, et al. A new method for detecting viable non-cultured state ofCampylobacterjejuni[J]. J Chin Insti Food Sci Tech, 2006, 6(4): 122-126. (in Chinese)

刘光明,蔡慧农,曹敏杰,等.一种检测活的非可培养状态空肠弯曲菌的新方法[J].中国食品学报, 2006, 6(4): 122-126.

Establishment of ELISA method for detectingCampylobacterjejunibased on the B-cell antigen epitope of OMP18

LOU Hong-qiang, GAO Su-hua, LI Xu-sheng, CHEN Hao-hao, HU Ye

(MedicalSchool,JinhuaPolytechnic,Jinhua321007,China)

This study aims to establish an ELISA method for detection ofCampylobacterjejuniinfection by using the B-cell antigen epitope polypeptide of OMP18 as the coating antigen. Using the B-cell epitope peptides with different concentrations (0.1,1 and 10 μg/mL) as the coating antigens, the rabbit anti-CampylobacterjejuniIgG antibody as the primary antibody and the HRP-labeled goat anti-rabbit IgG antibody as the secondary antibody, the researchers detect the levels of IgG antibody after different dilutions (1∶10, 1∶10 and 1∶1 000) based on its original concentration of 1 mg/mL. The researchers also compare different immunological specificities of epitope peptides via using the serum from a healthy rabbit, the serums respectively from the rabbits infected withCampylobacterjejuniandSalmonellaas the primary antibody as well as the HRP-labeled goat anti-rabbit IgG antibody(1∶3 000) as the secondary antibody. The immunoreactivity of three B cell antigen epitope polypeptides of OMP18 significantly increase in the dilutions of 1∶1 000,1∶4 000 and 1∶16 000 and 1∶64 000,while it finds the most significant increase in a 1∶1 000 dilution.Therefore, the B-cell epitope peptides of OMP18 indeed features an immunological specificity. And the study indicates that the ELISA is a desirable method capable of detectingCampylobacterjejuniinfection by using OMP18 B cell antigen epitope polypeptide as the coating antigen with a high immune response and a specific immunity.

Campylobacterjejuni; OMP18; antigenic epitope; enzyme linked immunosorbent assay

Hu Ye, Email: huye8254@vip.sina.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.008

浙江省公益性技术应用研究计划资助项目(No.2013C33215)；金华市科技研究计划资助项目(No.2013-3-017)；浙江省医药卫生计划资助项目(No.2013KYA214)

胡野，Email:huye8254@vip.sina.com

金华职业技术学院医学院，金华 321007

R378.2

A

1002-2694(2016)10-0889-04

2016-04-11；

2016-08-16

Supported by the Zhejiang Province Public Welfare Technology Application Research Project (No.2013C33215) and the Jinhua Science and Technology Research Project (No.2013-3-017),and the Zhejiang Medical and Health Project (No. 2013KYA 214)