陈皮提取物多种药效作用的谱效关系研究

罗　欢，卞　海，韩燕全，章俊如，夏伦祝，朱新维

（1.安徽中医药大学第一附属医院/国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽合肥230031；2.安徽中医药大学，安徽合肥230031）

陈皮提取物多种药效作用的谱效关系研究

罗欢1，卞海2，韩燕全1，章俊如1，夏伦祝1，朱新维2

（1.安徽中医药大学第一附属医院/国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽合肥230031；2.安徽中医药大学，安徽合肥230031）

●中医药学在世界上首先发现了中药并首创了方剂，医方是“除疾保性命之术”，而剂则有“调百药齐，和之所宜”之功。采用现代药物制剂技术重新研究并升华古典方剂之术，开创未来药物制剂技术和新剂型药物研究的全新思维和方向。

目的：了解陈皮SFE-CO2萃取物指纹图谱与化痰、抗炎和助消化药理作用的谱效关系。方法：建立陈皮SFE-CO2萃取物的GC指纹图谱，采用酚红排泌法、二甲苯致耳廓肿胀法、胃半固体糊排空法考察10批陈皮SFE-CO2萃取物的化痰、抗炎、助消化作用，并采用双变量相关分析法分析谱效关系。结果：谱效相关性分析结果表明，陈皮脂溶性成分中有10个色谱峰与化痰作用显著相关，14个色谱峰与抗炎作用显著相关，2个色谱峰与健胃作用显著相关。结论：谱效关系分析结果能够初步说明陈皮脂溶性成分化痰、抗炎、健胃等作用的物质基础。

陈皮；SFE-CO2萃取；脂溶性成分；GC-MS；指纹图谱；谱效关系

近年来以研究中药指纹图谱与其疗效之间的关系为目标的中药谱效学日渐兴起，它是建立在中药指纹图谱基础上，将中药指纹图谱中化学成分的变化与药效结果联系起来的一种研究手段［1］。采用指纹图谱与药效相结合的新模式，在不需各成分逐一分离纯化的情况下，可从整体上考察有效部位中各化学成分生物活性的大小，诠释混合物中各化学成分对药效的贡献程度，明确活性成分。为中药的质量控制提供了思路和研究方法，具有理论意义和实用价值。

陈皮为临床常用中药，具有止咳化痰、理气和胃等功效，中医临床多以水煎入药。近年来研究发现，陈皮脂溶性成分含量较高，也是其重要的药理活性成分。其脂溶性成分中主要含有右旋柠檬烯、蒎烯、萜烯以及丰富的多甲氧基黄酮类成分，对消化系统、呼吸系统、免疫系统等均有一定的药理作用，且生物利用度较高［2］。陈皮脂溶性成分的化学组成丰富，药理作用广泛，但二者之间的联系却未见文献报道。因此笔者认为，陈皮脂溶性成分的化学组成与药效之间的关系如何，是陈皮现代研究亟须解决的的问题。

1　材料与方法

1材料

1.1.1仪器VARIAN CP-3800气象色谱仪/ VARIAN SATURAN 2200质谱仪（美国瓦里安公司），色谱柱为CP-SIL 8CB石英毛细管柱（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）；HL-5L/50MPa-CWQⅡ型超临界CO2流体萃取设备（杭州市华黎泵业有限公司）；AG285型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；KQ3200DB型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；Agilent 8453E型紫外可见分光光度计（美国安捷伦科技公司）；KDC-16H高速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）。

1.1.2试药10批陈皮药材，来源信息见表1。复方氯化铵片（浙江康恩贝制药股份有限公司），阿司匹林肠溶片（南京白敬宇制药股份有限责任公司），多潘立酮片（上海信谊天平药业有限公司）。正己烷（天津市富宇精细化工有限公司）、无水硫酸钠（中国上海金山化工厂）等均为分析纯，氦气（纯度为99.9%）。

表1　本实验所用陈皮产地及批号

1.1.3实验动物昆明种小鼠360只（小鼠3批药效实验各120只），雌雄各半，体重18～22 g，动物合格证编号001886，由安徽长临河实验动物公司提供。

1.2方法与结果

1.2.1陈皮脂溶性成分的提取分别将10批陈皮药材粉碎，入萃取釜进行超临界CO2（SFE-CO2）萃取。萃取条件按照课题组前期研究得出的最佳萃取工艺［3］，即：萃取温度45℃，萃取压力25 MPa，分离釜I压力8 MPa，分离温度30℃，萃取时间2.0 h，CO2流量20 kg/h，陈皮粉碎度60目。得10批陈皮SFE-CO2萃取物（S1～S10）。

1.2.210批陈皮提取物指纹图谱的建立

1.2.2.1GC/MS色谱条件①色谱条件：CP-SIL 8CB石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；色谱升温程序为初始温度60℃（保持5 min），以8℃/min升温至220℃（保持2 min），然后保持至分析完成；气化室温度250℃：载气为高纯氦气，载气流量0.9 mL/min，进样量1 μL，分流比为1∶50。②质谱条件：MS电子能量70 eV，离子源温度150℃，延时3 min，扫描范围（m/z）30～650 amu。

1.2.2.2供试品制备与测定精密称定10批陈皮SFE-CO2萃取物样品各0.2 g，用正己烷定容至10 mL，置分液漏斗中萃取后取上层溶液，备用。分别精密吸取供试品溶液各1 μL进样测定。

1.2.2.3方法学考察①精密度试验：取S2的陈皮提取物供试液，在相同的色谱条件下连续进样6次，测得各共有峰的相对峰面积RSD均小于3%。表明仪器的精密度良好。②重复性试验：取陈皮（批号108896）共6份，按相同方法分别进行提取，制备出陈皮SFE-CO2萃取物供试液6份，在相同的色谱条件下进行分析，测得各共有峰的相对峰面积RSD均小于3%。表明试验方法的重复性较好。③稳定性试验：取S2的陈皮萃取物供试品溶液，分别在0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h不同时间点进样分析，测得各共有峰的相对峰面积RSD均小于3%，说明陈皮提取物供试品在16 h内稳定。

1.2.2.4样品测定在1.2.2.1项色谱条件下测定10批陈皮SFE-CO2萃取物样品，图1中A、B、C图分别是其中3批陈皮提取物的总粒子流图（TIC图）。色谱图中27个峰是各供试品共有的（图1中A图所示），因此确定这27个峰为共有峰。由于GC-MS色谱工作站所获得的数据与多种相似度评价系统均不兼容，故利用Excel工作表函数及数据分析程序计算27个特征成分的相对保留时间、相对峰面积。

图1　陈皮SFE-CO2萃取物的TIC图

1.2.3药效实验

1.2.3.1化痰作用小鼠120只，雌雄各半，随机分成空白对照组、1～10批陈皮SFE-CO2萃取物组、复方氯化铵组，每组10只。各组连续灌胃给药（剂量按公斤体重计算，相当于成人用生药量的10倍）或生理盐水7 d，末次给药前禁食24 h，自由饮水。末次给药后30 min，分别给各小鼠腹腔注射5%酚红10 mL/kg，30 min后颈椎脱臼处死小鼠，解剖小鼠，剥去气管周围组织，剪下自甲状软骨下至气管分支处的一段气管，放入盛有2 mL生理盐水的试管中，再加1 mol/L NaOH 0.1 mL，摇匀放置2 h，使气管的色素溶出。用8534E紫外可见分光光度计于波长546 nm处测吸光度（A）值，根据酚红标准液管的A值做回归方程，从而计算酚红排出量。结果见表2。

1.2.3.2抗炎作用小鼠120只，雌雄各半，随机分成模型组、1～10批陈皮SFE-CO2萃取物组、阿司匹林组。各组连续灌胃给药（剂量按公斤体重计算，相当于成人用生药量的10倍）或生理盐水7 d，末次给药前禁食24 h，自由饮水。末次给药后30 min，用二甲苯50 μL涂抹小鼠左耳的两侧致炎，右耳不做任何处理。涂药1 h后颈椎脱臼处死小鼠，剪下两耳，用直径为8 mm的打孔器切下两耳圆形耳片，立即精确称量质量，计算耳肿胀度和肿胀抑制率。结果见表3。

表2　陈皮SFE-CO2萃取物对小鼠呼吸道酚红排泌量的影响

表3　陈皮SFE-CO2萃取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀度的影响　（±s）

表3　陈皮SFE-CO2萃取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀度的影响　（±s）

注：与模型组比较，1）P<0.05，2）P<0.01

组别　剂量（g/kg）肿胀度（mg）抑制率（%）模型组　14.88±3.36阿司匹林组　0.043　4.25±1.49　71.402）S1陈皮SFE-CO2萃取物组　0.025　13.63±3.55　8.401）S2陈皮SFE-CO2萃取物组　0.025　12.88±4.06　13.441）S3陈皮SFE-CO2萃取物组　0.013　10.78±2.80　27.501）S4陈皮SFE-CO2萃取物组　0.019　9.63±2.72　35.291）S5陈皮SFE-CO2萃取物组　0.035　5.50±1.83　63.032）S6陈皮SFE-CO2萃取物组　0.014　13.44±3.89　9.621）S7陈皮SFE-CO2萃取物组　0.041　10.88±4.02　26.892）S8陈皮SFE-CO2萃取物组　0.017　8.56±1.96　42.481）S9陈皮SFE-CO2萃取物组　0.035　4.88±2.10　67.232）S10陈皮SFE-CO2萃取物组　0.014　8.33±1.06　43.971）

1.2.3.3促胃动力作用小鼠120只，雌雄各半，随机分成对照组、1～10批陈皮SFE-CO2萃取物组、多潘立酮组。各组连续灌胃给药（剂量按公斤体重计算，相当于成人用生药量的10倍）或生理盐水7 d，末次给药前禁食24 h，自由饮水。末次给药后30 min，各组小鼠灌胃半固体糊（5 g梭甲基纤维素、7 g奶粉、4 g糖、4 g淀粉加130 mL水，配成150 mL糊状物）0.8 mL/只，30 min后脱颈椎处死动物，沿腹白线剖开腹腔，结扎胃贲门和幽门。取胃用滤纸拭干后精确称量全重，然后沿胃大弯剪开胃体，洗去胃内容物后用滤纸拭干，精确称量胃净重，计算胃内残留率。结果见表4。

1.2.4谱效学研究利用SPSS17.0 for WindowsXP/ NT的双变量相关分析（Bivariate）方法进行数据处理，将共有峰的峰面积与各药效数据建立相关性［4］，得到陈皮脂溶性成分中各共有特征色谱峰与药效抑制率的相关系数。可见部分色谱峰与药效呈现正相关（P＜0.05，P＜0.01），即这些色谱峰对药效作用有显著影响。结果见表5，表6和表7。

表4　陈皮SFE-CO2萃取物对小鼠胃内残留率的影响（n=10，±s）

表4　陈皮SFE-CO2萃取物对小鼠胃内残留率的影响（n=10，±s）

注：与空白对照组比较，1）P<0.05，2）P<0.01

组别　剂量（g/kg）　胃内残留率（%）空白对照组　66.34±4.26多潘立酮组　0.040　29.70±5.031）S1陈皮SFE-CO2萃取物组　0.025　60.37±6.692）S2陈皮SFE-CO2萃取物组　0.025　56.31±2.311）S3陈皮SFE-CO2萃取物组　0.013　49.06±5.711）S4陈皮SFE-CO2萃取物组　0.019　59.11±9.841）S5陈皮SFE-CO2萃取物组　0.035　26.12±5.392）S6陈皮SFE-CO2萃取物组　0.014　36.74±3.512）S7陈皮SFE-CO2萃取物组　0.041　33.13±4.582）S8陈皮SFE-CO2萃取物组　0.017　35.56±9.712）S9陈皮SFE-CO2萃取物组　0.035　21.61±4.532）S10陈皮SFE-CO2萃取物组　0.014　32.11±9.071）

表5　色谱峰面积与酚红排泌数据的Pearson相关系数

结果表明，陈皮脂溶性成分中存在10个色谱峰与化痰药效显著相关（P<0.05），其中右旋柠檬烯、α-吡喃酮和芳酮与化痰药效呈非常显著相关（P<0.01）。14个色谱峰与抗炎药效相关性较大，其中长叶松萜烯、β-荜澄茄烯和月桂醇与抗炎药效呈非常显著相关。2个色谱峰与胃内残留率显著负相关，即与胃排空药效显著正相关，对应的化合物分别为β-水芹烯和香茅醛。

表6　色谱峰面积与耳肿胀抑制率数据的Pearson相关系数

表7　色谱峰面积与胃排空数据的Pearson相关系数

2　讨论

本文采用双变量相关分析法研究了所建立的陈皮SFE-CO2萃取物指纹图谱与化痰、抗炎和助消化药理作用的谱效关系。根据关联度与对应成分药理作用贡献程度成正比的原则，说明陈皮脂溶性成分中分别有10个、14个、2个化合物在化痰、抗炎和助消化药理作用中可能起到非常重要的作用，初步揭示了陈皮SFE-CO2萃取物发挥上述3种药理作用的物质基础。

分析结果表明，萃取物中含量最高的右旋柠檬烯（5号峰）与化痰作用的关联度最大，这与文献报道的柠檬烯具有祛痰平喘作用结果相一致［5］。与抗炎及胃排空作用关联度最大的成分分别为β-荜澄茄烯和香茅醛，未见文献报道其单体的相关药理活性，说明其药理作用可能是中药内在“化学成分群”发挥整体药效作用的结果。陈皮脂溶性成分及有效部位的提取分离将得到进一步研究。

［1］秦昆明，郑礼娟，沈保家，等.谱效关系在中药研究中的应用及相关思考［J］.中国中药杂志，2013，38（1）：26-30.

［2］李晓芳，张健康，王慧鸾，等.陈皮的研究进展［J］.江西中医药，2014，45（375）：76-78.

［3］罗欢，夏伦祝，韩燕全，等.正交设计优选陈皮超临界CO2萃取工艺［J］.山西中医学院学报，2012，13（1）：33-36.

［4］李康.医学统计学［M］.北京：人民卫生出版社，2013：206-229.

［5］王文渊，韩立路，张芸兰，等.橘皮柠檬烯的研究与应用进展［J］.精细与专用化学品，2012，20（5）：46-47.

（编辑：梁葆朱）

Investigation on spectrum-activity relationship between extracts from pericarpium citri reticulatae and its pharmacological action

Luo Huan1，Bian Hai2，Han Yanquan1，Zhang Junru1，Xia Lunzhu1，Zhu Xinwei2
（1.The First Hospital Affiliated to Anhui University of TCM，Hefei Anhui 230031； 2.Anhui University of TCM，Hefei Anhui 230031）

Objective：To establish GC finger prints of SFE-CO2extracts from pericarpium citri reticulatae and found the correlation between finger prints and its effect on dissipating phlegm，anti-inflammatory，digestive function.Methods：Supercritical fluid extracts in ten batches of pericarpium citri reticulatae were analyzed by GC-MS，and GC finger prints of its liposoluble components were established.Then experimental datas in phenolsulfonphthalein excretion experiment，xylene-induced ear edema experiment and gastric semisolid paste emptying experiment were conducted by bivariate correlation analysis.Results：Spectrum-activity relationship studies manifested，there were 10 chromatographic peaks associated with dissipating phlegm significantly，14 chromatographic peaks associated with anti-inflammatory significantly，and 2 chromatographic peaks associated with digestive function significantly in the liposoluble constituents of pericarpium citri reticulatae.Conclusion：Spectrum-activity relationship can explain material basis of drug action of liposoluble constituent in pericarpium citri reticulatae preliminarily.

pericarpium citri reticulatae；SFE-CO2；liposoluble constituents；GC-MS；finger print；spectrum-activity relationship

R285

A

1671-0258（2016）05-0022-04

2014年度安徽中医药大学科学研究基金项目（2014qn023）

罗欢，硕士，药师，E-mail：lhuan1229@163.com

夏伦祝，教授，E-mail：xialunzhu@sohu.com