HPLC法测定蛇伤胶囊中盐酸小檗碱含量

王炜辰，严国鸿，李　煌，徐　伟，褚克丹

（1.福建中医药大学附属人民医院药学部，福建福州350004； 2.福建中医药大学药学院，福建福州350122）

HPLC法测定蛇伤胶囊中盐酸小檗碱含量

王炜辰1，严国鸿1，李煌2，徐伟2，褚克丹2

（1.福建中医药大学附属人民医院药学部，福建福州350004； 2.福建中医药大学药学院，福建福州350122）

目的：建立蛇伤胶囊中盐酸小檗碱含量的测定方法。方法：色谱柱为Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液-乙腈（75∶25）；柱温：35℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：346 nm；进样量：10 μL。结果：盐酸小檗碱含量在0.101 μg～1.008 μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系（r=0.999 9），平均回收率为97.36%，RSD=1.23%（n=6）。结论：该方法简便快速，重复性好，可为蛇伤胶囊的质量控制提供依据。

高效液相色谱；蛇伤胶囊；盐酸小檗碱

蛇伤胶囊是福建省人民医院蛇伤专科的特色制剂，具有泻火解毒、凉血消肿等功效，临床上用于治疗毒蛇咬伤、毒蜂蜇伤等，疗效良好，广受患者好评。该院内制剂原标准中无含量测定项，本实验拟采用HPLC法测定胶囊中主要药味黄连中盐酸小檗碱的含量，为更好地控制制剂质量提供依据。

1　实验材料

1.1实验仪器

Ultimate-3000型高效液相色谱仪（美国戴安公司），包括LPG-3400SD四元梯度泵、WPS-3000SL自动进样器、TCC-3000RS柱温箱；Chromeleon 6.80色谱工作站。赛多利斯CPA255D电子分析天平（0.01 mg，Sartorius）；KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TU-1201型紫外分光光度计（北京市通用仪器设备公司）；JZC-3TSC电子天平（福州科迪电子技术有限公司）。

1.2试药与试剂

盐酸小檗碱对照品（批号110713-200208，中国食品药品检定研究院），乙腈、甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司），磷酸二氢钠、盐酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），实验用水为自制去离子水。3批蛇伤胶囊（福建中医药大学附属人民医院制剂室自制，批号130606，140317，140825）。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液-乙腈（75∶25）（pH 4.0）；柱温：35℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：346 nm；进样量：10 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱对照品5.04 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备取蛇伤胶囊，倾出内容物，混匀，取粉末7 g精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（100∶1）的混合溶液50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷；再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，得滤液1。滤渣重复以上操作再次提取，将所得滤液2与滤液1合并，摇匀，浓缩至50 mL，精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液的制备按蛇伤胶囊处方量取除黄连外的其他药材，照制剂制备工艺制成缺黄连的阴性对照品，再按“2.2.2”供试品项下方法制得阴性对照溶液。

2.3系统适应性试验

精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl，按照“2.1”项下色谱条件进样测定。结果显示，阴性对照在盐酸小檗碱保留时间处无干扰峰出现，结果见图1。

2.4线性关系考察

精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL、10 mL置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，各精密吸取10 μL注入液相色谱仪进行测定，以对照品进样量X（μg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线，回归方程为Y=59.538 0X-1.028 1（r=0.999 9），结果见表1、图1。可见，盐酸小檗碱在0.101 μg～1.008 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

表1　盐酸小檗碱对照品线性考察试验结果

2.5方法学考察

2.5.1精密度试验精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测得盐酸小檗碱峰面积的RSD为0.452%，表明仪器精密度良好。

2.5.2重复性试验取同一批样品（批号140825）适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件进样测定，结果盐酸小檗碱峰面积RSD为1.05%（n=6），表明该方法重复性良好。

图1　系统适应性试验色谱图

2.5.3稳定性试验精密吸取同一份供试品溶液10 μL，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样测定，结果盐酸小檗碱峰面积的RSD为1.59%，表明供试品溶液中的盐酸小檗碱在24 h内稳定。

2.5.4加样回收率试验精密称取同一批号样品（140825）共6份，加入相应量的盐酸小檗碱对照品，按“2.2.2”项下方法制备并测定，计算回收率，结果见表2。6次加样回收率测定结果均在95%～105%之间，平均回收率为97.36%，RSD为1.23%，表明本方法准确可靠。

2.6样品测定

取蛇伤胶囊3批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件进样测定，计算样品中盐酸小檗碱含量，结果见表3。

表2　加样回收率试验

表3　3批蛇伤胶囊样品含量测定结果

3　讨论与总结

黄连是蛇伤胶囊中的重要药味，其主要成分盐酸小檗碱含量测定的方法很多，采用HPLC法测定具有简便易行、灵敏度高、重复性好、准确度高等优点。本次实验依据2010版《中国药典》中含小檗碱成分的原料药及中成药并参考相关文献来考察含量测定条件。

3.1供试品制备条件筛选

提取溶剂的选择。在供试品制备的过程中考察了不同溶媒的提取效果，分别选用60%乙醇、60%甲醇、甲醇［1］、盐酸-甲醇（1∶100）［2］、乙腈-0.1% H3PO4溶液［3］超声30 min后注入液相色谱仪进行比较。结果表明同样是50 mL溶媒，盐酸-甲醇（1∶100）溶液提取率最高。

提取方法的考察。使用盐酸-甲醇（1∶100）作为溶媒，考察超声、加热回流［4］、索氏提取30 min，结果显示超声提取率高，而且重复性强，3次测得的含量RSD为0.55%，操作方便快捷，所以选择超声作为提取方法。

提取时间的考察。使用盐酸-甲醇（1∶100）作为溶媒，分别对4个同批次样品超声15 min、30 min、45 min、60 min，结果显示15 min提取不够完全，30 min、45 min提取的含量基本相同，60 min提取的含量略低。为了节省时间，快速检测，选择提取时间为30 min。

提取次数的考察。使用盐酸-甲醇（1∶100）作为溶媒，超声提取30 min，分别提取1、2、3次，发现提取2次基本能将小檗碱提取完全。所以用盐酸-甲醇（1∶100）50mL作为溶媒，超声提取2次，每次30min。

3.2系统适应性试验条件筛选

吸收波长的选择。使用紫外分光光度计于200 nm～700 nm全波长扫描盐酸小檗碱标准品及蛇伤胶囊阴性样品，结果显示盐酸小檗碱在230 nm、265 nm、346 nm波长处均存在吸收峰，其中230 nm、265 nm处专属性较差，杂质有吸收，346 nm处响应值高且无杂峰干扰，故选定346 nm为检测波长。

流动相的选择。查找文献，选择乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液［4］、乙腈-0.05 mol/L NaH2PO4［2，5］、乙腈-0.05 mol/L KH2PO4［6-8］4种类型溶剂作为流动相，必要时加入离子对试剂十二烷基硫酸钠或扫尾剂三乙胺［9］，通过调节有机相与水相的比例来比较他们之间的分离效果。结果显示三乙胺和十二烷基硫酸钠加入后影响柱效，数据重复性不高，实验结束后不易洗脱，故不予采用；乙腈-水系统拖尾较严重；乙腈-0.1%磷酸溶液系统稍好，但是小檗碱峰的对称性仍超过1.05；乙腈-0.05 mol/L NaH2PO4溶液系统与乙腈-0.05 mol/L KH2PO4溶液相比，前者在分离度、峰形等诸多因素方面略优于后者，可能是因为离子半径不同从而影响了色谱行为。故选乙腈-0.05 mol/L NaH2PO4溶液为流动相，配比为25∶75，磷酸调节pH为4.0，盐酸小檗碱出峰时间合适，对称性良好。

本次实验结果表明，所建立的方法简便快速，稳定性好，可为蛇伤胶囊的质量控制提供参考。

［1］郤庆.HPLC法测定安心颗粒中盐酸小檗碱的含量［J］.中国药师，2014，17（3）：512-514.

［2］叶秀金.HPLC测定清肺抑火丸中盐酸小檗碱的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2011（3）：90-92.

［3］张采琼.HPLC法测定清热宁肾胶囊中盐酸小檗碱的含量［J］.成都大学学报（自然科学版），2014（2）：118-120.

［4］缪珊，栗艳，李捷，等.HPLC法测定参蛇软膏中盐酸小檗碱的含量［J］.中国药师，2014，17（9）：1 576-1 578.

［5］陈威，赵东凤，史红娟，等.HPLC法测定栀子金花分散片中盐酸小檗碱的含量［J］.承德医学院学报，2014（1）：17-19.

［6］彭艳梅.HPLC法测定金英胶囊中盐酸小檗碱的含量［J］.湖南中医杂志，2014（2）：129-130.

［7］冯瑛，夏正燕，潘建明.HPLC法测定黄连降糖片中盐酸小檗碱的含量［J］.中药新药与临床药理，2009（1）：70-71.

［8］张春玲.HPLC法测定金赤苓胶囊中盐酸小檗碱含量［J］.中国社区医师（医学专业），2011（12）：8-9.

［9］李彩虹，彭罡，周克元.RP-HPLC定量三乙胺法测定中药黄连中盐酸小檗碱的含量［J］.东南大学学报（医学版），2012（1）：8-11.

（编辑：梁葆朱）

Determination of berberine hydrochloride in Sheshang capsules by HPLC

Wang Weichen1，Yan Guohong1，Li Huang2，Xu Wei2，Chu Kedan2
（1.Pharmaceutical Department，People′s Hospital Affiliated to Fujian University of TCM，Fuzhou Fujian 350004；2.School of Pharmacy，Fujian University of TCM，Fuzhou Fujian 350122）

Objective：To establish a method for determination of berberine hydrochloride in Sheshang capsules.Method：The analysis was performed on a Diamonsil-C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）with a mobile phase of 0.05 mol/L sodium dihydrogen phosphate-acetonitrile（75∶25）at a detection wavelength of 346 nm and a flow rate of 1.0 mL/min.The column temperature was set at 35 degrees.The injection volume was 10 μL.Results：The content of berberine hydrochloride showed a good linear relationship in the range of 0.101 μg～1.008 μg（r=0.999 9）.The average recovery rate was 97.36%，RSD=1.23%（n=6）.Conclusion：The content determination method is simple，sensitive，accurate and reproducible，which provides the experimental basis for quality improvement of Sheshang capsules.

HPLC；Sheshang capsules；berberine hydrochloride

R286

A

1671-0258（2016）05-0026-03

王炜辰，E-mail：weichen@163.com