牛肉中磺胺类药物残留的检测分析

张筱艳，方素栎，魏晋梅

（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州730070；2.甘肃农业大学研测中心，兰州730070）

营养与饲料

牛肉中磺胺类药物残留的检测分析

张筱艳1，方素栎1，魏晋梅2

（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州730070；2.甘肃农业大学研测中心，兰州730070）

为建立用高效液相色谱法同时测定牛肉中6种磺胺类药物（磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、苯酰磺胺、磺胺二甲氧哒嗪）残留的方法。牛肉样品经均质匀浆、乙酸乙酯提取后，用MCX柱净化，洗脱液洗脱，6种磺胺类药物以0.1%甲酸-乙腈为流动相，在C18色谱柱上（100 mm×4.6 mm）分离。结果表明：6种磺胺药物浓度在0.01～5.00 μg/mL范围内，其标准曲线的相关系数（R2）在0.999 1～0.999 8范围内，加标回收率为67.6%～73.8%，相对标准偏差RSD为2.56%～7.12%（n=3），检出限为0.004～0.017 μg/mL。所检测的样品中无磺胺类药残检出。

牛肉；高效液相色谱法；磺胺类药物；残留

磺胺类药物是指含有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，主要用于预防和治疗畜禽细菌感染性疾病，通常混在饲料中或直接口服，由于其抗菌谱广、价格低廉、性质稳定等特点，成为畜禽抗感染治疗的重要药物之一，但其使用不当会残留于动物源性食品中，可直接或间接通过食物链对人体产生毒副作用，引发排尿和造血紊乱等副作用和过敏反应，使免疫功能下降，致残、致畸、致突变，并且可能产生致癌作用［1-4］。目前临床上使用的磺胺类药物有20余种，欧盟、中国、美国、日本、国际食品委员会对动物源性食品中磺胺类药物残留规定了最大残留限量值，严格控制磺胺类药物在畜牧业中的应用。在我国，农业部第235号公告规定磺胺类药物在所有动物源性食品中的最高残留限量为100 μg/kg［5］；欧盟及美国一些国家明确规定食品中磺胺类药物总含量不超过0.1 mg/kg［6］；2006年，日本实行的“肯定列表制度”规定，部分磺胺类药物的残留量需执行“一律标准”为0.01 mg/kg，并且禁止使用磺胺喹噁啉和磺胺二甲基嘧啶这两种磺胺类兽药［7］。

目前，对于运用高效液相色谱法检测鸡肉、猪肉、水产品、牛奶、蛋黄和蛋清中磺胺类药物残留分析方法报道较多［8-20］，但使用HPLC法同时检测牛肉中多种磺胺类药物残留的报道较少。本研究采用HPLC法同时检测牛肉中6种磺胺类药物残留，为相关药物残留的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器、材料与试剂

Agilent 1200 series（美国Agilent公司，配有多波长紫外检测器）；C18色谱柱（100 mm×4.6 mm）；离心机。

磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺间甲氧嘧啶（SMM）、磺胺甲噁唑（SMZ）、磺胺异噁唑（SIZ）、苯酰磺胺（SBM）、磺胺二甲氧哒嗪（SDX）6种标准品（中国兽医药品监察所、Dr. EhrenstorferGmbH），纯度为98%；试验用牛肉样品采自甘肃省某肉牛屠宰场，在-20℃以下冷冻保存。

乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、盐酸、正己烷、甲酸（色谱纯）、0.1%甲酸溶液、0.1%甲酸乙腈溶液、0.1 mol/L盐酸溶液、50%甲醇乙腈；水为蒸馏水。以上试剂除特殊注明外均为分析纯试剂。

1.2 色谱条件

流动相：0.1%甲酸-乙腈=84-16（梯度）；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；检测波长：270 nm；进样体积：10 μL。

1.3 标准溶液的配制

磺胺类药物标准储备液：准确称取6种磺胺类药物标准品各10.0 mg，分别置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1.0 mg/mL的磺胺标准储备液。

磺胺类药物混合标准中间液：精确量取6种磺胺标准储备液各1 mL于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度为10.0 μg/mL的磺胺类药物混合标准中间液。-20℃避光保存，有效期6个月。使用时用流动相稀释成所需浓度的标准工作液。

1.4 样品前处理

原始样品室温下解冻，将取样牛肉切碎，用均质机均质成肉泥状。称取均质后样品5.00 g±0.05 g，置于50 mL离心管，加乙酸乙酯20 mL，涡动2 min，4 000 r/min离心5 min，取上清液于100 mL鸡心瓶中，残渣中加乙酸乙酯20 mL，重复提取一次，合并两次提取液。

净化：MCX柱依次用甲醇2 mL和0.1 mol/L盐酸溶液2 mL活化，取备用液过柱，控制流速1.0 mL/min。依次用0.1 mol/L盐酸溶液1 mL和50%甲醇乙腈溶液2 mL淋洗，用洗脱液4 mL洗脱，收集洗脱液，于40℃氮气吹干，加0.1%甲酸乙腈溶液1.0 mL溶解残余物，过0.22 μm滤膜过滤，HPLC测定。

2 结果与分析

2.1 6种磺胺类标准品色谱图

取10 μg/mL磺胺类药物的混合标准中间液适量，用0.1%甲酸乙腈溶液稀释，配制成浓度为0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、2.50和5.00 μg/mL的标准工作液，依次进行HPLC分析，得色谱图。以测得的6种磺胺类药物的响应值（峰面积，y）和相对应的浓度（μg/mL，x）进行线性回归，得回归方程和相关系数（R2）（表1）。

图1为6种磺胺类药物（SAs）混合标准对照液浓度均为0.50μg/mL时HPLC色谱分离图。6种SAs在10min内即可实现快速、有效的分离，保留时间稳定，峰形尖锐、峰对称性佳。

表1 6种磺胺类药物的标准曲线回归方程及相关系数

图1 6种磺胺类药物混合标准工作液色谱图

2.2 方法的准确度和精密度

经HPLC检测无干扰峰出现的牛肉样品，确定为空白样品（图2）。取均质后的空白样品，添加磺胺标准品各100 μg/kg作为空白添加对照组（图3）。按1.4的方法提取、净化，以回收率检验方法的准确度和精密度，每个添加水平设3个平行样品进行测定。结果表明，6种磺胺类药物的回收率均在67.6%～73.8%之间，相对标准偏差（RSD）为2.56%～7.12%（表2）。

表2 加标回收试验结果（n=3）

图2 空白样品色谱图

图3 加标色谱图

2.3 检出限

表3为6种磺胺类药物的检出限。

表3 6种磺胺类药物的检出限 μg/mL

2.4 样品检测结果

运用上述方法对所采集的牛肉样品进行检测，结果表明本次检测的牛肉样品中均未检出6种磺胺类药物。

图4为所采样品按照上述方法处理后，经HPLC分析所得的色谱图。

图4 采集的牛肉样品检测色谱图

3 结论

本试验应用高效液相色谱法同时检测了牛肉中6种磺胺类药物，整个出峰周期控制在10 min内，达到了快速定量检测的目的。通过本试验对所抽检的某屠宰场的牛肉进行磺胺类药残检测，结果显示样品中6种磺胺类药物均未被检出。

［1］ RicoAG.Drugresidues in animals［M］.NewYork：Academic Press，1986：33.

［2］ Littlefield N A，Sheldon W G，Allen R，et al.Chyonic toxicity/carcinogenicity studies of sulphamethazine in Fischer 344/N rats:Two-generationexposure［J］.Food&ChemicalToxicology，1990，28（3）：157-167.

［3］ Dixon-Holland D E，Katz S E.Competitive direct enzyme-linked immunosorbentassayfordetectionofsulfamethazineresiduesinswineurine and muscle tissue［J］.J Assoc OffAnal Chem，1988，71（6）：1137-1140.

［4］ KoE，SongH，ParkJH.Directcompetitive enzyme-linked immunosorbent assayfor sulfamethazine［J］.J Vet Med Sci，2000，62（10）：1121-1123.

［5］ 农业部兽医局.动物性食品中兽药最高残留限量［EB/OL］.2002.

［6］ 农业部畜牧兽医局.农业部发布动物性食品中兽药最高残留限量［J］.中国兽药杂志，2003，37（4）：15-20.

［7］ 聂青平.动物源性食品的养殖药残问题不可忽视［J］.广东饲料，2002（3）：7-9.

［8］ Won So Young，Chang Hee Lee，Hye Sook Chang，et al.Monitoring of 14 sulfonamide antibiotic residues in marine products using HPLCPDAand LC-MS/MS［J］.Food Control，2011（22）：1101-1107.

［9］ KaoYM，ChangMH，ChengCC，et al.Multiresidue determination of veterinary drugs in chicken and swine muscles by high-performance liquid chromatography［J］.Journal of Food and Drug Analysis，2001（9）：84-95.

［10］W Hela，MBrandtner.Determination of sulfonamides in animal tissues using cation exchange reversed phase sorbent for sample clean up and HPLC-DADfor detection［J］.Food Chemistry，2003，83：601-608.

［11］杨静，王世山，刘树军，等.HPLC法检测猪肉中5种磺胺类药物残留的研究［J］.生物技术，2011，38（12）：119-121.

［12］孙晶玮，赵新淮.牛奶中多种磺胺类抗生素残留的HPLC快速分析［J］.食品科学，2007，28（6）：256-259.

［13］张小军，郑斌，陈学昌.高效液相色谱-荧光检测法测定水产品中4种磺胺类药物残留量［J］.食品科学，2009，30（8）：235-237.

［14］宋艳红，王冉，刘铁铮.高效液相色谱法测定蛋清和蛋黄中五种磺胺类药物残留［J］.浙江农业学报，2007，19（1）：42-45.

［15］吴银良，赵莉，刘勇军，等.固相萃取-高效液相色谱法同时测定牛奶中残留的9种磺胺类药物［J］.色谱，2007，25（5）：728-731.

［16］方国凯.动物源性食品中痕量磺胺兽药残留的分析［J］.食品研究与开发，2007，28（5）：101-104.

［17］蔡英华，吴银良，刘素英，等.反相高效液相色谱法测定鸡蛋中磺胺类药物残留量［J］.质量监督与检验，2007，2：24-27.

［18］李孟玻，张德云，彭之见，等.高效液相色谱法测定鱼肉中残留磺胺类药物［J］.理化检验—化学分册，2006，42（8）：611-619.

［19］刘铁铮，王冉，柳伟荣，等.鸡蛋中7种磺胺药物的多残留检测方法研究［J］.食品科学，2005，26（11）：183-186.

［20］Yu Chunhe，Bin Hu.C18-coated stir bar sorptive extraction combined with high performance liquid chromatographyelectrospraytandemmass spectrometry for the analysis of sulfonamides in milk and milk powder［J］.Talanta，2012，90：77-84.

Sulfonamides Residues Detection in Beef

ZhangXiaoyan1，FangSuli1，Wei Jinmei1，2
（1.College ofAnimal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Research and Detection Center，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

A high performance liquid chromatography method was developed for the simultaneous determination of six sulfonamides residues in beef，which were sulfamethazine，sulfamonomethoxine，sulfadoxine，sulfisoxazole，sulfabenzamide，sulfamethoxazole.The beef samples were dissolved by homogenize and extracted with ethyl acetate，and cleaned up on by a silica MCX.The sixsulfanilamides residues were separated on Gemini C18column（100×4.6 mm）at a constant temperature of35℃by using a mobile phase of 0.1%formic acid and acetonitrile at a flow rate of 1.0 mL/min.The results showed that the calibration curves were linear in the range of0.01～5.00 μg/mLwith a correlation coefficient ofmore than 0.999 and the limits ofquantification were 0.004～0.017 μg/mL for the six analytes.The extraction recoveries were 67.6%～73.8%and the RSD between 2.56%～7.12%（n=3）.Nosulfonamides residues were detected in the beefsample.

beef；high performance liquid chromatography（HPLC）；sulfonamide；residue

TS251.52

A

2095-3887（2016）03-0034-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.03.009

2016-04-01

甘肃省科技厅自然科学基金项目（1010RJZA202，1208RJZA156）

张筱艳（1991-），女，硕士研究生。

方素栎（1970-），女，副教授。研究方向：动物生产。