乾华肉用美利奴羊血红蛋白多态性的研究

阮洪玲，项露颉，白 曼，孙丽敏，马 龙，姜怀志

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118；2.吉林乾安志华种羊繁育有限公司，乾安131404）

乾华肉用美利奴羊血红蛋白多态性的研究

阮洪玲1，项露颉1，白 曼1，孙丽敏1，马 龙2，姜怀志1

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118；2.吉林乾安志华种羊繁育有限公司，乾安131404）

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（PAGE）分析乾华肉用美利奴羊的血红蛋白（Hb）多态性。结果表明：乾华肉用美利奴羊血红蛋白多态性存在HbA和HbB两种变异体，构成了HbAA、HbAB和HbBB三种基因型。其中HbAA、HbAB和HbBB基因型频率分别为0.17、0.20和0.63，基因杂合度为0.39；HbA基因频率为0.27，HbB基因频率为0.73，以HbB为优势基因。该研究旨在对乾华肉用美利奴羊的保种选育以及生产提供理论指导。

乾华肉用美利奴羊（暂定名）；血红蛋白；多态性

血红蛋白（hemoglobin，简称Hb）是脊椎动物的一种含铁的复合变构蛋白，也是动物体内含量最多的蛋白质之一。血红蛋白不仅能运载氧气和二氧化碳，还具有氧化酶活性和抗菌等功能。1955年，Harris等首先在阿尔及利亚通过滤纸电泳法鉴定出了绵羊存在两种Hb遗传变异体，即HbA和HbB，并认为这种现象是由一对等位基因HbA和HbB所控制，组成了HbAA、HbAB和HbBB三种基因型，且具有多态性［1］。他们的新发现开拓了Hb领域的研究工作。血红蛋白不仅是机体重要的生化遗传标记，也是目前研究最多的动物机体血液蛋白质之一［2］。张才骏等［3-5］也曾对青海半细毛羊、青海细毛羊、茨盖羊、藏羊等青海高原绵羊的Hb多态性做过大量的研究。大多数研究结果都表明，绵羊血红蛋白多态性的类型与生产性能、繁殖能力、海拔高度以及机体抗病力之间具有一定的联系。

乾华肉用美利奴羊（暂定名），是吉林省自2003年起以纯种南非肉用美利奴羊为父本，级进杂交东北细毛羊至F3后，选择理想型个体进行横交固定，所培育出的具有肉毛兼用特征的细毛羊新品种，目前已进入选育提高阶段。乾华肉用美利奴羊具有体质结实、结构匀称、肌肉丰满、适应性强、耐粗饲等优良特性。因此，本研究以乾华肉用美利奴羊为研究对象，检测其血液血红蛋白的多态性，旨在更深入地了解乾华肉用美利奴羊生化遗传特性，更为该品种选育提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

在乾安志华种羊繁育有限公司的育种核心群中，选择体质结实，健康的羔羊、育成羊、成年羊各10只，均公母各半，共计30只。

1.2 血液样品的采集和处理

早晨空腹，颈静脉采血5 mL，注入添加抗凝剂的真空采血管。带回实验室，取1 mL抗凝血，加入1～2倍体积的生理盐水，混合均匀，3 500 r/min离心3 min。洗涤之后，小心吸取上清液，只留下浓缩的压积红细胞。按1∶30比例加入双蒸水，充分混匀，在4℃下静置4 h，进行低渗破溶处理。经过低渗处理后，4℃下3 500 r/min离心10 min，除去一些还未破碎的红细胞及其他杂质。最后，4℃下12 000 r/min离心15 min，去除沉淀。取上部清亮的红色透明液为血红蛋白溶液，供Hb电泳分析用。

1.3 Hb电泳和分型

1.3.1 电泳 配制10%分离胶溶液，缓冲液为Tris-HCl（pH=8.8）；配制5%浓缩胶溶液，缓冲液为Tris-HCl（pH值6.8）；吸取血红蛋白样品30 μL与10 μL溴酚蓝混合后点样10 μL，电泳开始时电压为100 V，待样品进入分离胶界线后调至200 V，稳压电泳1 h。取下凝胶放入考马斯亮蓝染色液中（至少5倍胶体积），放入水平摇床，染色过夜后再进行醋酸脱色，每30分钟更换1次脱色液，最后将凝胶置于凝胶成像仪中进行拍照。

1.3.2 分型 判型参考佐佐木清纲［6］记载的标准以及张才骏等［7］的判定标准判型。

1.4 数据处理

将所得试验数据整理后，使用SPSS17.0统计软件进行统计与分析。按照实测数值计算Hb基因型频率，按照其受1对共显性等位基因HbA和HbB控制的假设计算基因频率。

基因型频率=该基因型个体数/被测个体总数

基因频率=2（ii）+（ij1）+（ij2）+A（ijn）/2N

式中：i表示纯合等位基因型个体，jl…jn表示共显性的第n个基因型个体，N为样本总数。

按照以下公式计算基因杂合度：H=1-∑P2i。式中，Pi为某一位点第i个等位基因频率。

Hardy-Weinberg平衡检测采用χ2分析进行适合性检验。

2 结果与分析

从图1、图2和表1可见，乾华肉用美利奴羊的血红蛋白溶液经PAGE，分离出HbA和HbB两种变异体，以HbB为优势基因。构成了HbAA、HbAB和HbBB三种基因型，基因型频率分别为0.17、0.20和0.63，基因杂合度为0.39。HbA基因频率为0.27，HbB基因频率为0.73。对乾华肉用美利奴羊各组绵羊Hb的基因型频率经χ2检验，无显著性差异（P＞0.05）。表明该场乾华肉用美利奴羊Hb的基因型频率和基因频率已达到哈代—温伯格遗传平衡状态。

图1 乾华肉用美利奴羊Hb电泳图谱

图2 乾华肉用美利奴羊Hb电泳模式图谱

表1 乾华肉用美利奴羊Hb基因型频率和基因频率

3 讨论与小结

血红蛋白在动物体内担负着运送氧气和二氧化碳的重要生理学功能，研究动物血红蛋白的结构与功能对揭示动物进化具有重要意义。本试验用聚丙烯酰胺凝胶电泳法研究乾华肉用美利奴羊Hb型的结果与Harris等［1］的结果一致，检出乾华肉用美利奴羊血红蛋白多态性存在HbA和HbB两种变异体，构成了HbAA、HbAB和HbBB三种基因型，且HbA基因频率为0.27，HbB基因频率为0.73。

张才俊等［3］在藏羊的研究结果中表明，海拔高度对绵羊Hb基因频率影响较大。HbA具有较强的与氧气结合的能力。生活在海拔2 000 m地区的藏羊的HbA基因频率为0.29，到了海拔4 000 m以上则上升至0.93。这种变化是由于绵羊长期处于低氧环境生存的结果。魏春红等［8］对小尾寒羊、同羊和陕北滩羊Hb基因频率检测的结果也证实了这种推测。本研究结果表明，乾华肉用美利奴羊HbA基因频率显著低于海拔较高地区的HbA基因频率。这是由于吉林省乾安地区属于平原地区，因此试验中HbB基因在乾华肉用美利奴羊群体中为优势基因，证实了以上观点。该群体基因杂合度小，说明乾华肉用美利奴羊Hb位点遗传变异较小，遗传比较稳定。

Barowicz等［9］研究发现，HbBB基因型母羊的产羔率最高，HbAB型次之，HbAA型最低。杨广礼等［10］研究认为，高繁殖力的小尾寒羊的HbBB基因型频率、HbB基因频率远高于产单羔的甘肃藏羊，可以作为多羔性的遗传标记。王欣荣等［11］研究报道，小尾寒羊Hb位点，HbBB型母羊第2胎的产羔数极显著大于HbAB基因型。本研究结果表明，HbB基因在乾华肉用美利奴羊群体中为优势基因。由于HbB基因对繁殖力具有良好的影响［12］以及有髓毛含量较低［13］等优点，可以将HbBB基因型作为遗传标记进行选择，以提高选择效率。由此可以推测，乾华肉用美利奴羊群体中的HbBB基因型也与产羔数相关。

［1］ Harris H，Warren F L.Occurrence of electrophoretically distinct hemoglobin in ruminants［J］.Biochem，1955（60）：29.

［2］ 王永科，卢福山，安贝，等.青海半细毛羊血红蛋白多态性及其与血清生化指标的相关性分析［J］.安徽农业科学，2014，42（14）：4354-4355.

［3］ 张才骏，张武学，张更利，等.引入青海的新疆细毛羊和茨盖羊血红蛋白多态性的研究［J］.青海畜牧兽医杂志，1988（6）：1-4.

［4］ 张才骏.青海半细毛羊血液生化遗传多态性的研究［J］.青海畜牧兽医杂志，2004（1）：3-5.

［5］ 张才骏，张武学，张更利，等.青海省绵羊血红蛋白多态性的研究［J］.青海畜牧兽医学院学报，1993（2）：8-14.

［6］ 佐佐木清纲.家畜的血液型及其应用［M］.李世安，译.上海：上海科学技术出版社，1982.

［7］ 张才俊，张武学，李军祥，等.青海细毛羊血红蛋白和血细胞蛋白质多态性的研究［J］.青海畜牧兽医杂志，1996（1）：8-10.

［8］ 魏春红，邱怀.同羊、陕北滩羊和小尾寒羊血红蛋白的多态性［J］.畜牧兽医杂志，1992（1）：1-2.

［9］ Barowicz T.Relationship between productivity and hemoglobin types in Polish Long-wool sheep［J］.Animal Breeding Abstracts，1985，53（3）：213.

［10］杨广礼，罗玉柱.小尾寒羊血液蛋白多态性与多羔性研究［J］.甘肃农业大学学报，2004（4）：381-385.

［11］王欣荣，张利平.小尾寒羊血液蛋白（酶）多态性与产羔数的比较研究［J］.中国草食动物，2005，25（2）：31-33.

［12］Wahn H，Hammerschmidt S.Relationships between hemoglobin type and reproduction，lamb，wool and milk production and health-related traits in crossbred ewes［J］.Journal of Animal Science，1980，50（3）：418-27.

［13］Nazifi S，Mosleh N，Ranjbar VR，et a1.Reference values ofserumbiochemical parameters in adult male and female Iranian chukar partridge（Alectoris chukar）［J］.Aust J Basic Appl Sci，2011，5（3）：252-256.

S826.2

A

2095-3887（2016）03-0082-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.03.022

2016-03-22

吉林省教育厅”十二五”科学技术项目（吉教科合字［2015］第186号）；吉林省科技发展计划项目（20120802）；吉林省现代农业产业技术体系建设专项基金（201541）

阮洪玲（1991-），女，硕士研究生。

姜怀志（1968-），男，教授，博士，博士生导师，主要从事绒山羊种质特性与选育的研究。