中甸牦牛mtDNA D-Loop区遗传多样性及系统进化分析

涂世英，汪 琦，柴志欣，钟金城

（1.云南省动物卫生监督所，昆明650000；2.西南民族大学，动物遗传育种学国家民委-教育部重点实验室，成都610041；3.西南民族大学，青藏高原研究院，成都610041）

中甸牦牛mtDNA D-Loop区遗传多样性及系统进化分析

涂世英1，汪 琦2，3，柴志欣2，3，钟金城2，3

（1.云南省动物卫生监督所，昆明650000；2.西南民族大学，动物遗传育种学国家民委-教育部重点实验室，成都610041；3.西南民族大学，青藏高原研究院，成都610041）

根据牦牛线粒体DNA序列设计引物，扩增获得了中甸牦牛线粒体D-loop区全序列，并以山羊为外属对牛亚科部分牛种（野牦牛、九龙牦牛、麦洼牦牛、西藏牦牛、天祝牦牛、青海牦牛、大通牦牛、美洲野牛、欧洲野牛、印度野牛、亚洲水牛和普通牛）的mtDNA D-loop序列进行了系统进化分析，以期了解中甸牦牛的遗传多样性，从而为中甸牦牛遗传资源的保护、开发和利用奠定理论基础。结果表明：①中甸牦牛线粒体D-loop区序列长在890～910 bp之间，T、C、A、G四种碱基的平均含量分别为28.78%、24.41%、32.34%和14.47%，存在一定的碱基组成偏倚性；②中甸牦牛共有13种单倍型，平均单倍型多样性（Hd）为0.983 3，平均核苷酸多样性（Pi）为0.005 34，遗传多样性较为丰富；③中甸牦牛与已知牛种mtDNA D-loop区序列双参数距离显示，其与麦洼牦牛距离最小（0.006），与亚洲水牛距离最大（0.179）；④系统进化分析显示，中甸牦牛是我国众多家牦牛类群中的一支，与麦洼牦牛聚为一类，推测其可能与麦洼牦牛因地理位置存在基因交流，由共同祖先进化而来。

中甸牦牛；D-loop区；牛亚科；系统发育

doi：10.3969/j.issn.2095-3887.2016.03.002

牦牛是青藏高原特有的珍稀家畜品种，是高寒草地不可替代的生物资源，已成为青藏高原地区畜牧业发展的独立板块。中甸牦牛主要分布在海拔3 000 m以上的高寒地区，是云南迪庆高原地区特有的畜种，主产于中甸县尼西、格咱、大中甸、小中甸等藏族聚居的乡镇，在大理州高寒地区也有分布，数量以迪庆中甸县最多，是我国优良牦牛类型之一［1］。中甸牦牛毛色以黑色居多，其次为黑白花，公母都有角，角为黑色或灰白，体格粗壮结实，具有耐寒耐粗饲，乳肉品质优良和抗病力强等优良种质特性［2-3］。由于受中甸地区社会经济、自然气候条件以及公犏牛不育等因素制约，目前仍处在用本地黄牛与牦牛杂交繁殖犏牛的阶段，因此将来对中甸牦牛的研究主要集中在适宜高寒自然环境的生理特性和改良遗传性状等方面。

线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）因具有母系遗传、多态性丰富以及结构简单等特点，被认为是研究物种起源、演化和分类最好的分子遗传标记［4］，其中D-loop区进化速度快，变异较大，适用于对亚科内属、种间的系统学研究［5］。张成福等［6-7］通过测定西藏牦牛类群的D-loop区序列对西藏牦牛的遗传多样性、类群间亲缘关系和系统进化关系进行了研究；李齐发等［8］通过测定九龙牦牛的D-loop区全序列并对其进行了系统发育分析。目前尚未见云南中甸牦牛线粒体基因的相关报道。本研究利用DNA测序技术，测定了中甸牦牛线粒体基因D-Loop区全序列，并以羊亚科（Caprinae）中的山羊（Capra hircus）作为外类群，以及部分牛品种（野牦牛、九龙牦牛、麦洼牦牛、西藏牦牛、天祝牦牛、青海牦牛、大通牦牛、美洲野牛、欧洲野牛、印度野牛、亚洲水牛和普通牛）进行系统进化分析，探究中甸牦牛的遗传多样性及其物种间的亲缘关系，以期从分子水平上探讨牛亚科不同物种间的系统进化关系及中甸牦牛的分类地位，为中甸牦牛遗传资源的进一步保护、定向育种、开发和利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在云南省迪庆中甸县，选取成年健康的中甸牦牛（15头），采集耳组织样品，75%乙醇保存带回实验室，存于-20℃的冰箱中备用。

1.2 基因组DNA的提取及检测

运用动物组织基因组提取试剂盒（TianGen生物技术公司）提取基因组DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别检测DNA的纯度和浓度，－20℃保存备用。

1.3 引物设计与序列扩增

根据GenBank中公布的普通牛线粒体DNA序列（AF492351.1），利用Primer Premier 5.0设计1对引物扩增三江黄牛的D-loop区，引物序列F：CTGCAGTCTCAC CCATCAACC；R：GGGGTGTAGATGCTTGC，由英潍捷基（上海）生物科技有限公司合成。

PCR反应体系为25 μL。其中，上、下游引物各1 μL（10 pmol/μL），DNA模板1 μL（200～600 ng/μL），2×long Taq DNA预混酶12.50 μL（0.625 U），ddH2O（纯化水）9.50 μL。

PCR扩增条件：94℃预变性2 min；94℃变性15 s，57.7℃退火15 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸3 min，4℃保存。

1.4 目的基因克隆测序

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测目的片段大小，再用DNA纯化试剂盒（由TianGen公司生产）进行回收分离纯化，直接连接到pMDTM19-T载体（由TaKaRa公司生产）上，并转化到高效感受态细胞DH5α中，LB平板培养基（含有2%X-Gal、1%IPTG和1%Amp）上37℃培养12～16 h，筛选阳性克隆在700 μLLB液体培养基（含1%Amp）中37℃振荡培养6～7 h。重组子经菌液PCR鉴定后，送往英潍捷基（上海）生物科技有限公司进行正反双向测序。

1.5 牛亚科部分牛种和外类群构建D-loop区序列的来源

选取牛亚科中具有代表性的牛种和中甸牦牛进行系统建群分析，包括野牦牛（Poephagus mutusc）、九龙牦牛（Jiulong yak）、麦洼牦牛（Maiwa yak）、西藏牦牛（Xizang yak）、天祝牦牛（Tianzhu yak）、青海牦牛（Qinghai yak）、大通牦牛（Datong yak）、美洲野牛（Bison bison）、欧洲野牛（Bison bonasus）、印度野牛（Bison gaurus）、亚洲水牛（Bubalus bubalis）、普通牛（Bos taurus）与中甸牦牛（Zhongdian yak）比对分析，并选取与牛亚科亲缘关系较近的羊亚科中的山羊（Capra hircus）作为系统发育分析的外类群，从GenBank上下载这些相关牛种D-loop区的全序列（见表1）。

1.6 数据分析和系统进化分析

选取扩增所得中甸牦牛线粒体DNA D-loop区序列以及从GenBank下载的所有序列用DNAMAN进行序列编辑整理，再用clustalX软件进行序列同源性比对，利用Dnasp 5.0软件统计三江黄牛线粒体DNAD-loop区的核苷酸单倍型数目（number ofhaplotypes）、单倍型多样度（haplotype diversity）、核苷酸多样性（nucleotide diversity）、平均核苷酸差异（average number ofnucleotide differences）等，并对所有突变位点进行Tajima中性检验。用MEGA5.0软件统计三江黄牛核苷酸序列的碱基组成、转换/颠换比（transition/transversion，Ts/Tv），并用Kimura2-parameter模型计算遗传距离，运用邻接法（NJ）与其他各牛种构建系统发育树，自举分析（bootstrap test）1 000次重复抽样检验获得置信度（BP）。

表1 牛亚科代表性牛种和外类群的D-loop区序列

2 结果与分析

2.1 中甸牦牛mtDNA D-loop区的PCR扩增

中甸牦牛mtDNAD-loop区PCR扩增产物凝胶电泳（图1），目的片段大小1 000 bp左右，与预期结果一致，表明扩增成功。

2.2 中甸牦牛mtDNA D-loop区的核苷酸组成及多样性

通过测序可知，15头中甸牦牛mtDNA D-loop区全长均在909～911 bp之间，存在碱基插入、缺失和替换，共有51个变异位点，其中15个插入或缺失位点，36个转化或颠换位点，转换/颠换（Ts/Tv）比1.77，表明中甸牦牛核苷酸多态性的变异主要以转换为主，其中A→G/C→T转换次数最多，颠换次数较少。在转换变异类型中以A/G和T/C为主，在插入类型以C碱基为主。单态突变位点35个，占多态位点总数的68.63%，简约信息位点16个，占多态位点总数的31.37%。T、C、A、G四种碱基的平均含量为28.78%、24.41%、32.34%和14.47%，G+C含量为38.88%，A+T的含量为61.12%，说明中甸牦牛mtDNA D-loop区富含A/T碱基，具有一定偏倚性。

图1 中甸牦牛线粒体DNAD-loop区扩增产物

用Dnasp5.0软件对15头中甸牦牛个体的单倍型进行多样性分析（表2），结果表明，中甸牦牛共有13种单倍型，平均单倍型多样性（Hd）为0.983 3，平均核苷酸多样性（Pi）为0.005 34。对所有的突变位点进行Tajima中性检验，得到Tajim’D值：1.465 04＞0.1，表明差异不显著，所有的变异均符合中性进化。

表2 中甸牦牛mtDNAD-loop区的单倍型分布

2.3 中甸牦牛与各牛种类群间D-loop区遗传多样性差异

除印度野牛外，所列各牛种中4种碱基分布情况大致相同（表3），T、C、A、G四种核苷酸的平均含量分别为 28.66%（28.36%～29.18%）、25.11%（24.40%～25.51%）、32.36%（31.69%～32.85%）、13.87%（13.34%～14.47%），其中A/T含量（61.02%）明显高于G/C含量（38.98%），表明各牛种线粒体DNA D-loop区均富含碱基A和T。

牛亚科内部分牛种类群间D-loop区序列差异百分比见表4。由表4可知，中甸牦牛与美洲野牛的序列差异最小，为1.96%，与其他几种家牦牛的序列差异百分比在5.42%～7.99%之间，与印度野牛差异最大，为25.70%。在牛亚科中，九龙牦牛和大通牦牛序列无差异，麦洼牦牛和天祝牦牛序列也无差异；麦洼牦牛、西藏牦牛、天祝牦牛与青海牦牛的序列间差异较小，为0.11%，而与印度野牛、亚洲水牛的序列差异百分比较大（23.29%～33.58%）；这与以往的研究结果基本一致。

表3 牛亚科部分牛种和外类群的D-loop区段的碱基组成%

表4 牛亚科内不同物种间线粒体DNAD-loop区序列差异百分比%

2.4 中甸牦牛与各牛种类群间的遗传距离及系统进化分析

根据中甸牦牛和各牛种类群间线粒体DNA D-loop区碱基序列，用Mega 5.0软件计算14个牛种间的遗传距离（表5）。结果表明，14个牛种间的遗传距离范围在0～0.192之间，其中中甸牦牛和亚洲水牛的距离最大（0.179），与麦洼牦牛遗传距离最短（0.006），这表明它们的亲缘关系较近，麦洼牦牛是主要分布于四川省的优良草地型地方品种，而中甸牦牛常年在云南高海拔草场上放牧生存，两者均属于家牦牛，推测因地理位置接壤可能存在基因交流，亲缘关系上可能由共同的祖先进化而来。在其他牛种中，欧洲野牛与普通牛的遗传距离最远（0.186），天祝牦牛与青海牦牛的遗传距离最短（0.001）。

根据各牛种间的遗传距离，以山羊作为外类群，用邻接法（NJ）构建分子系统进化树（图2）。由图2可知，牛亚科和外类群（山羊）分别各自聚为一类，牛亚科内，亚洲水牛与其他物种各自聚为一类；中甸牦牛和麦洼牦牛聚在一起，再与九龙牦牛、大通牦牛、天祝牦牛和青海牦牛相聚，同属于家牦牛的分支。中甸牦牛分布于云南省，而麦洼牦牛分布于四川省，两地的距离较近，由此推测，两者存在地理上的亲缘关系或是基因交流。此外，野牦牛和西藏牦牛聚为一类，欧洲野牛和普通牛聚为一类，聚类结果与以往的动物分类学结果基本一致。

表5 牛亚科各牛种间Kimura双参数遗传距离

图2 基于Kimura双参数遗传距离的各牛种类群间NJ系统进化关系

3 讨论

遗传多样性是所有生物多样性的重要组成部分，它是生物进化和物种分化的基础［9］，也对种群维持繁衍和适应生境变化具有重要意义。由于Cytb、l2S rRNA等线粒体编码基因的变异过程较慢，常用来进行种以上等级的系统发育关系重建［10］，而mtDNA D-Loop区的序列变异则较快，因此被用来进行种以下水平的系统关系研究。通常动物mtDNA进化主要以核苷酸转换为主，插入和缺失较少，核苷酸的转换是插入和缺失的2～10倍，而在mtDNAD-Loop区核苷酸的转换概率更是远大于核苷酸插入和缺失的概率。家牦牛丰富的遗传多样性对我国乃至全世界牦牛产业的可持续发展起着举足轻重的作用。

目前对家牦牛的mtDNA D-loop区研究主要集中在四川牦牛和西藏牦牛上。赖松家等［5］运用测序技术测定了中国5个家牦牛品种的mtDNA D-loop区全序列，表明我国牦牛mtDNA D-loop单倍型类型丰富并有2个母系来源，分别是横断高山型和青藏高原型两大生态类型；钟金城等［11］和肖玉萍等［12］采用RAPD和AFLP标记对九龙牦牛、麦洼牦牛、大通牦牛和天祝白牦牛进行了分析，结果表明九龙牦牛的遗传多样性最为丰富，天祝白牦牛遗传多样性最低，4个牦牛品种聚为两大类：九龙牦牛为一类，其他3个牦牛品种聚为一类，这与本研究聚类分析所得结论基本一致。钟金城等［13］和柴志欣等［14］用RAPD引物对西藏11个牦牛群体进行研究，表明西藏牦牛类群内部具有较多遗传变异，推测西藏西部可能是牦牛的起源地之一。

本研究以动物mtDNAD-loop区为分子标记，对中甸牦牛mtDNAD-loop区进行序列分析，结果显示，15头中甸牦牛mtDNA D-loop区序列长度在890～910 bp之间，个体间差异较小。通过对中甸牦牛mtDNA D-loop区序列的比对分析，发现T、C、A、G四种碱基的平均含量为28.78%、24.41%、32.34%和14.47%，碱基组成偏好性明显。中甸牦牛平均单倍型多样性（Hd）为0.983 3，平均核苷酸多样性（Pi）为0.005 34，序列变异存在碱基插入、缺失和替换，共有51个变异位点，其中15个插入或缺失位点，36个转化或颠换位点，转换/颠换（Ts/Tv）比1.77，表明中甸牦牛种内遗传多样性丰富，这与田应华等［15］利用微卫星标记技术对中甸牦牛分析的结果一致，揭示中甸牦牛群体变异在中国牦牛地方群体中处于较高水平。

本研究对14个牛亚科部分牛种进行遗传距离和系统进化分析，显示中甸牦牛是我国家牦牛中的一个品种，与麦洼牦牛遗传距离最近，为0.006，说明两者关系较近，中甸牦牛产自云南省，而麦洼牦牛产自四川省，两地的距离较近，并且中甸牦牛和麦洼牦牛同属草地型牦牛，生活在高山草甸草场，因此推测两者可能存在基因交流。所构建的系统发育树显示，牛亚科中水牛属最早分化出来，然后是印度野牛、欧洲野牛与普通牛、美洲野牛、家牦牛与野牦牛的分支；聚类分析结果表明，欧洲野牛与普通牛的亲缘关系较近，另外美洲野牛与牦牛之间亲缘关系较近，这与郭松长等［10］所得出的结果一致；系统进化树还显示，西藏牦牛和野牦牛是一个分支，这也和以往得出的的研究成果相同，现在的家养牦牛起源于我国的西藏，野牦牛则是家养牦牛的近缘野生种［16］。以牦牛化石作为考证，野牦牛与家牦牛都曾分布在欧亚大陆东北部，是原始牦牛的后代，由于地壳运动、气候变化等原因迁移至我国青藏高原地区，并适应了高寒、缺氧等生态环境从而生存下来，因此今天的家牦牛和野牦牛都由同一祖先进化而来，它们之间不存在祖先和后代的关系［17］。

目前对中甸牦牛的遗传多样性研究尚未见报道，本研究首次对中甸牦牛的遗传多样性和系统进化作了系统全面的研究。中甸牦牛是我国优良地方家牦牛品种之一，是我国众多牦牛类群中的一支，其群体遗传变异程度较高，遗传多样性较丰富，该结果可为中甸牦牛遗传资源的进一步保护、定向育种、开发和利用提供理论基础。

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Analysis on Genetic Diversity and Phyletic Evolution of Mitochondrial DNA D-loop Region from Zhongdian Yak

Tu Shiying1，WangQi2，3，ZhongJincheng2，3，et al
（1.The Animal Health Supervision，Yunnan Province，Kunming650000，China；2.KeyLaboratoryofAnimal Genetics and BreedingofState Ethnic Affair Commission and MinistryofEduction，Chengdu 610041，China；3.Qinghai-Tibet Plateau College，Southwest Universityfor Nationalities，Chengdu 610041，China）

The Zhongdian yak mitochondrial D-loop area was cloned using a specific primers designed according to the mitochondrial DNA sequence of yak，which was then used for phylogenetic analysis combined with the mtDNA D-loop sequence of bovine typical cattle breeds，including Poephagus mutusc，Jiulong yak，Maiwa yak，Xizang yak，Tianzhu yak，Qinghai yak，Datong yak，Bison bison，Bison bonasus，Bison gaurus，Bubalus bubalis and Bos Taurus，with that of sheep as the exogenous reference.These data may be beneficial for our understanding the genetic diversity of Zhongdian yak，and put forward the theoretical foundation for the protection，development and utilization of genetic resources of Zhongdian yak.The results showed that，①Zhongdian yak mitochondrial D-loop area sequence length between 890～910 bp.T，C，A，G took the average content of 28.78%，24.41%，32.34%and 14.47%，respectively，and there was a certain base composition of bias；②a total of 13 Zhongdian yak haploid type with the average haploid typediversity（Hd）of 0.983 3，the average nucleotide diversity（Pi）of 0.005 34 was identified；③Zhongdian yak shared the minimum sequence distance with that ofMaiwa yak（0.000 6），and hit the maximum sequence distance on Asian buffalo（0.179），which was used the Kimura two-parameter genetic distance with known cattle mtDNA D-loop region sequences；④phylogenetic evolution analysis found that Zhongdian yak is an independent yak breeds，obtained the Maiwa yak into one group，and speculated that yak presence ofgene flowdue totheir location，it was evolved froma common ancestor.

Zhongdian yak；D-loop region；bovine；phylogeny

S823.8+5

A

2095-3887（2016）03-0005-06

2016-03-24

四川省科技计划项目（2015JY0248）

涂世英（1968-），女，高级畜牧师。研究方向：牦牛生产学。

钟金城（1963-），男，教授，博士。研究方向：动物遗传学。