HIF-lα和HIF-2α基因在藏绵羊不同组织中的表达及其意义

李少斌，焦 丹，王继卿，刘 秀，罗玉柱

（甘肃省草食动物生物技术重点实验室，甘肃省牛羊基因改良工程实验室，甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070）

HIF-lα和HIF-2α基因在藏绵羊不同组织中的表达及其意义

李少斌，焦 丹，王继卿，刘 秀，罗玉柱

（甘肃省草食动物生物技术重点实验室，甘肃省牛羊基因改良工程实验室，甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070）

高原低氧适应性研究对于了解高原土著动物的遗传进化和高原疾病的治疗有着重要意义。HⅠF（hypoxia inducible factor）是氧信号转导系统的重要转录因子，在细胞的低氧应答中起着关键作用。实验旨在研究HIF-lα和HIF-2α基因表达特征在藏绵羊低氧适应中的意义。采用RT-qPCR技术对藏绵羊HIF-la和HIF-2a基因进行了组织表达分析。结果表明：HIF-lα和HIF-2α基因在藏绵羊的8种组织（心、肝、脾、肺、肾、大脑、小脑和脑干）中均有表达。HIF-lα基因在肺和小脑中有高水平表达，其他依次是肾、脑干、大脑、心、脾和肝。HIF-2α基因在肺中表达水平最高，其他依次是脑干、心、肾、小脑、大脑和肝。结论：该研究首次证实，HIF-lα和HIF-2α基因在藏绵羊脾、大脑、小脑和脑干中均有表达，且HIF-lα在小脑中的表达水平较高。HIF-lα和HIF-2α基因在藏绵羊上呈表达广泛性和组织差异性，与其他高原土著动物有着类似的表达特征。这种个别组织HIF-lα和HIF-2α表达水平的提高提示，其正是维持低氧环境下生物体功能活动正常运转的分子基础。

HIF-lα；HIF-2α；藏绵羊；mRNA表达；低氧适应

高原低氧环境能够引起动物机体的一系列生理反应，严重时可导致高原病。高原土著动物主要通过体型外貌、行为特征、生长发育和生理生化功能等变化来适应低氧环境［1-3］。探索高原土著动物低氧适应性机制，有助于了解动物的进化、高原疾病和种质资源开发利用。对于低氧适应的研究包括整体、器官、细胞和分子水平，而目前主要集中在分子水平。

HIF是氧信号转导系统的重要转录因子，在细胞的低氧应答中起着关键作用。HIF由α和β两个亚基构成，其中α为调节亚基，β为构建亚基。目前发现，α亚基存在3种异构体，HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α。HIF-lα和HIF-2α是细胞在低氧状态下最主要的调节因子。HIF-lα和HIF-2α在动物中表现为多组织表达，且有明显的组织差异性。藏绵羊是青藏高原最主要的畜种之一，其对高原低氧环境有着良好的适应性。揭示高原动物的低氧适应机制，对于了解动物的遗传进化及高原病的预防治疗有着积极的意义。本实验拟研究藏绵羊HIF-lα和HIF-2α基因表达的组织差异性，为藏绵羊低氧适应机制的研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 藏绵羊选自甘肃省合作市某屠宰场，共5只，屠宰后立即提取组织样品，DEPC灭菌水冲洗后并置于液氮中保存备用。所采集组织包括心、肝、脾、肺、肾、大脑、小脑和脑干。

1.1.2 主要试剂 Trizol（Invitrogen产品）、PrimeScript RT Reagent kit和SYBR PremixExTaq（TaKaRa产品）。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 参照刘芳［4］设计的引物，内参基因选择l8S rRNA（见表1）。引物由华大基因公司合成。

表1 引物名称、序列、预期产物大小及退火温度

1.2.2 RNA提取和cDNA合成 按照Trizol试剂盒说明提取各组织总RNA，纯度和完整性检测后，DNaseⅠ处理除去可能混入的基因组DNA，按照TaKaRa公司反转录试剂盒的使用说明将RNA反转录成cDNA，-20℃保存备用。

1.2.3 表达分析 采用SYBR○RGreenⅠ荧光定量PCR两步法进行表达分析。所用仪器为罗氏LightCycler○R480 System。采用20 μL反应体系：SYBR PremixEx TaqTMⅡ10μL、引物各0.8μL、cDNA模板2μL和灭菌双蒸水6.4μL。每个组织重复3次。荧光定量PCR条件：95℃预变性：30 s（升温速率4.4℃/s）1循环，95℃变性5 s（升温速率4.4℃/s），60℃反应30 s（升温速率2.2℃/s，Acquistion Mode：Single）40循环。随后进行溶解曲线分析。

1.3 统计分析

采用 2-△△Ct法进行相对定量分析，其中△Ct= CtHIF-lα或HIF-2α-Ctl8SrRNA，△△Ct=△Ct组织-△Ct肝。

2 结果

经检测HIF-lα和HIF-2α基因在藏绵羊的8种组织中均有表达。根据检测出的Ct值，经2-△△Ct法计算，发现2个基因均在肺组织中的表达最高，在肝组织中的表达最低（见表2）。其中，HIF-lα基因在肺和小脑中有高水平表达，其他依次是肾、脑干、大脑、心、脾和肝。HIF-2α基因在肺中表达水平最高，其他依次是脑干、心、肾、小脑、大脑和肝。同时，在肺和脑干中2个基因的表达个体间差异比较大。值得注意的是，HIF-lα基因在小脑中的表达水平很高，基本与肺中的持平，而HIF-2α基因在小脑中的表达较低。

表2 HIF-lα和HIF-2α基因在藏绵羊各组织中的表达水平比较

3 讨论

氧是动物生存不可或缺的关键因子之一，在能量代谢和信号传导中起着关键作用。为了维持氧平衡，动物机体形成了复杂的呼吸系统和循环系统。低氧是人和动物高原生存的不利因素之一。在低氧应答中，转录因子HIF在氧信号转录中起着至关重要的作用，通过调控其靶基因发生系列应答反应，如增加红细胞数量、调节葡萄糖代谢和细胞外机制等。也正是由于其功能的重要性，HIF表达于所有研究过的后生动物中［5］。

本研究采用实时荧光定量PCR法检测了HIF-lα和HIF-2α基因在藏绵羊不同组织中的表达，结果显示在心、肝、脾、肺、肾、大脑、小脑和脑干中2个基因均有表达，且均在肺组织中表达水平最高。这种表达广泛性和组织差异性与其他高原动物（牦牛、高原属兔、高原根田鼠）的研究结果一致［6-8］。目前已有关于藏绵羊HIF-lα和HIF-2α基因组织表达的研究，但只研究了心、肝、肺、肾和骨骼肌5种组织，且是作为藏羚羊研究的对照组［4］。本研究首次证实，2个基因在藏绵羊脾、大脑、小脑和脑干中均有表达，且HIF-lα在小脑中表达水平比较高。这种组织特异性调节在小鼠、藏鸡和鱼类等动物上已经得到证实［9-11］。Stroka等［9］研究表明，小鼠低氧暴露，HIF-lα在脑、肾、肝、心和骨骼肌表达水平会提高，但表达量和代谢动力学表现出组织差异性。印度鲶属于低氧耐受性较强的鱼类，短期低氧暴露导致HIF-lα和HIF-2α在脑、肝和肾中的表达增加，但长期低氧暴露导致HIF-lα在脾和HIF-2α在肌肉中的表达增加［11］。高原动物个别组织HIF-lα和HIF-2α表达水平的提高提示其正是维持低氧环境下生物体功能活动正常运转的分子基础。

4 结论

HIF-lα和HIF-2α基因在藏绵羊的心、肝、脾、肺、肾、大脑、小脑和脑干中均有表达。HIF-lα和HIF-2α基因在藏绵羊上呈表达广泛性和组织差异性，这种个别组织表达水平的提高提示其正是维持低氧环境下生物体功能活动正常运转的分子基础。

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Expression and Significance of HIF-lα and HIF-2α Genes in Tibetan Sheep

Li Shaobin，JiaoDan，LuoYuzhu，et al
（Gansu KeyLaboratoryofHerbivorous Animal Biotechnology，Gansu EngineeringLab ofGenetic Improvement in Ruminants，College ofAnimal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

Hypoxia adaptation research has important significance on understanding genetic evolution of highland animal and treatment ofhigh altitude disease.HIF（hypoxia inducible factor）is an important transcription factor in oxygen signal transduction system，which plays a keyrole in cellular hypoxia response.In this study，Tibetan sheep were selected tostudythe expression and significance of HIF-lα and HIF-2α genes using RT-qPCR technique.The results showed that both HIF-lα and HIF-2α genes expressed in the eight tissues（heart，liver，spleen，lung，kidney，brain，cerebellum and brain stem）.HIF-lα gene had high level expressioninlungandcerebellum，theexpressionorderinothertissueswaskidney＞brainstem＞brain＞heart＞spleen＞liver.HIF-2α expression showed that the highest level was in the lung，followed bybrain stem，heart，kidney，cerebellum，brain and liver.It was demonstrated for the first time that these two genes were expressed in spleen，brain，cerebellum and brain stem，and the expressionlevelofHIF-lαinthecerebellumwasrelativelyhigh inTibetansheep.TheexpressionofHIF-lα andHIF-2α genes in the Tibetan sheep were extensive and with organizational differences，and had similar expression profiles with other highland indigenous animals.The increasement of expressionlevels of the HIF-lα and HIF-2α in some individual organizations suggested that this was molecular mechanism for maintaining normal functions ofthe organisms under a lowoxygen environment.

HIF-lα；HIF-2α；Tibetan sheep；mRNAexpression；hypoxia adaptation

S826.2

A

2095-3887（2016）03-0011-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.03.003

2016-02-29

国家科技支撑计划项目（2012BAD13B05-02）；甘肃省国际科技合作专项（1304WCGA178）；甘肃农业大学盛彤笙科技创新基金项目（GSAU-STS-134）；甘肃省青年科技基金计划项目（1308RJYA025）；甘肃省高等学校科研项目（2015B-052）

李少斌（1983-），男，助理研究员，硕士研究生。研究方向：现代生物技术与动物育种。

罗玉柱（1962-），男，教授，博士生导师。研究方向：现代生物技术与动物育种应用。