利用PCR技术鉴定异性孪生母牛留用价值

姬琳堡，杨永在，王长水，何 阳，梁艺洵，张兴隆，曹兵海

（中国农业大学动物科技学院，动物营养国家重点实验室，北京100193）

利用PCR技术鉴定异性孪生母牛留用价值

姬琳堡，杨永在，王长水，何 阳，梁艺洵，张兴隆，曹兵海

（中国农业大学动物科技学院，动物营养国家重点实验室，北京100193）

为鉴定异性孪生母牛是否具有留用价值，选取12头异性孪生荷斯坦母牛，根据异性孪生不育母牛性染色体是嵌合体XX/XY，而正常母牛性染色体为XX，通过PCR技术扩增特异性存在于Y染色体上的SRY基因来确定异性孪生母牛是否具有留用价值。如果检测出SRY基因则判定异性孪生母牛不育，不具有留用价值；如果未检测出SRY基因，则判定异性孪生母牛具有留用价值。该方法快速准确，便于早期决定异性孪生母牛的去留。

PCR技术；异性孪生母牛；性染色体嵌合体

近年来，随着同期发情、超数排卵和人工授精等技术的大量使用，奶牛双胎率从1983年的1.4%升高到1993年的2.4%［1］，目前中国荷斯坦奶牛的双胎率3%～4%，特别是多胎次高产奶牛的双胎率达5%以上［2］。按照概率计算，50%的双胎是异性孪生，而95%以上的异性孪生母犊不孕。奶牛是价值较大的家畜，由于生长周期长，无繁殖力的母牛在经济上会带来较大损失。如果将异性孪生母牛全部淘汰同样会面临经济上不必要的损失。因此，双胎对生产的影响逐渐引起人们的重视，及时有效地鉴别出异性孪生不孕母牛是否具有留用价值也有利于降低生产成本。

鉴定异性孪生不育母牛的方法很多，主要是外部观察法、探棒法以及分子学早期诊断方法。外部观察法只适用于成年母牛，在犊牛时期很难看出异性孪生母牛与正常母牛的区别［3］。探棒法即制作一根标有刻度的木棒，从犊牛阴道探入，通过探入长度来鉴定是否先天生殖器官发育不全［4］。分子学方法包括细胞遗传学鉴定、H-Y抗原法、X染色体相关酶法、Y染色体特异DNA探针杂交法及PCR法。其中PCR技术具备准确高效的特性，操作简单，易于应用［5］。

1990年人们克隆到Y染色体短臂上的性别决定区基因SRY，它是单拷贝基因，具有性别决定基因的性质，是目前性别决定的最佳候选基因，该基因在哺乳动物中是高度保守的［6］。目前在畜禽性别控制研究领域，如胚胎性别早期鉴定、精子分离等方面人们主要利用SRY基因来确定研究对象的性别［7］。

异性孪生不育或自由马丁是牛最常见的间性嵌合体形式［8］。异性双胎的胎盘血管连接导致XX/XY间性嵌合体的发生，雌性生殖道发育异常，从而引发雌性不育［9］。本研究基于异性孪生不育母牛为性染色体嵌合体XX/XY，而正常母牛性染色体为XX，利用PCR技术鉴定异性孪生不育母牛是否有必要留养。

1 材料与方法

1.1 实验样品的采集

待鉴定动物为出生日龄相差不超过1周的异性孪生荷斯坦母牛。在2月龄时，采用颈静脉采血方式，采集12头待鉴定异性孪生不孕母牛的全血，并以相同方式采集3头正常荷斯坦公牛和3头正常荷斯坦母牛的全血。实验共18个样品，每个样品10 mL，肝素钠抗凝，-20℃保存。

1.2 DNA的提取

选用天根生化科技（北京）有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）。具体提取步骤如下：

（1）将200μL血液样品加入离心管中，再加入600μL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5 min，期间再颠倒混匀几次。10 000 r/min离心1 min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200 μL缓冲液GA，震荡至彻底混匀。

（2）加入20 μLProteinase K溶液，混匀。

（3）加入200 μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃水浴至溶液变清亮。

（4）加入200 μL无水乙醇，充分震荡混匀15 s。

（5）将所得溶液和沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12 000 r/min离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

（6）向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000 r/min离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

（7）向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000 r/min离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

（8）重复上一步。

（9）将吸附柱CB3放回收集管中，12 000 r/min离心2 min，倒掉废液。室温放置数分钟，晾干残余漂洗液。

（10）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置3 min，12 000 r/min离心2 min，将溶液收集到离心管中。

1.3 目的基因的筛选

根据自由马丁效应的机理，异性孪生母牛不孕是因为性染色体是嵌合体XX/XY。正常母牛性染色体是XX。因此找到一个位于Y染色体上的基因，即可证明待测母牛是否是异性孪生不育母牛。SRY基因是特异性位于Y染色体上的基因，如果检测出SRY基因则判定待测母牛不孕，如果未检测出SRY基因则判定为待测母牛可孕。

（1）从美国国立生物技术信息中心（NCBI）网找到牛的SRY基因组序列，并利用Primer Premier 6.0软件根据引物设计规则，设计引物如下：F 5'-AGAGTATTGAACG ACGATGT-3'；R 5'-TGTGAGTATGTGGTCTTGG-3'；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

（2）检测引物特异性，确定最佳退火温度为57.7℃。

1.4 PCR扩增

PCR反应在BIO-RADS1000型PCR仪上进行。

反应体系共20 μL，其组成为：2 μL上游引物，2 μL下游引物，10 μLTaq酶，2 μLDNA模板，4 μLdd H2O。

循环参数为：95℃预变性5 min，然后95℃变性30 s，57.7℃复性30 s，72℃延伸30 s，共34个循环，最后72℃延伸10 min。

1.5 琼脂糖凝胶电泳

取3 μLPCR扩增产物与2 μL Buffer混匀后，经1%琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像分析系统观察结果并记录。

1.6 PCR产物的序列测定

PCR产物序列由北京六合华大基因科技股份有限公司测定。

2 结果与分析

对18头牛的SRY基因进行扩增，结果见图1。从图1可以看出，样本1、5、8、11～13均没有扩增产物。样本2～4、6、7、9、10、14～17都扩增出了496 bp的片段。BLAST的结果表明，所扩增的片段与牛的SRY基因序列同源性为100%。说明本实验扩增出的片段是牛的SRY基因片段。在所检测的19个样本中，1号为空白，样本用ddH2O替代，没有扩增出目的条带。2、3、4号为阳性对照，是正常荷斯坦公牛，其性染色体为XY，所以扩增出SRY基因片段。11、12、13号为阴性对照，是正常荷斯坦母牛，其性染色体为XX，不存在Y染色体，所以没有扩增出目的条带。5～10、14～19为待测样本，其中，样本5、8、18没有扩增出SRY基因片段。其余9头待测母牛6、7、9、10、14～17、19均扩增出目的条带。判定为XX/XY性染色体嵌合体母牛，不具备生育能力。

3 讨论

异性双生无繁殖力母牛的最佳鉴定时期是在性成熟以后，成年母牛时期，异性孪生不育母牛表现出与正常母牛不一样的外部特征，因此通过外部特征也可以从侧面印证实验结果。曹德祥等［3］在异性双生无繁殖力荷斯坦母牛的鉴定中提到，异性孪生不育母牛的特征包括：泌乳器官发育不正常，乳房组织没有增生发育，乳头非常小且紧贴腹壁。外生殖组织发育异常，异性孪生母牛阴蒂处多毛，且比正常母牛大，而且明显外翻。为进一步验证PCR技术的鉴定结果，在母牛成长过程中持续关注其外部特征，至14月龄时采集异性孪生母牛的图片如图2～4。

图2 性染色体嵌合体母牛外阴发育情况

图3 性染色体嵌合体母牛乳腺发育情况

图4 未检出SRY基因的母牛乳腺发育情况

无论是否检测为性染色体嵌合体的异性孪生母牛，在14月龄时的乳腺发育情况都不及正常单胎荷斯坦母牛。如图3～4所示，未被检测出SRY基因的异性孪生母牛与被检测为性染色体嵌合体的异性孪生母牛乳腺发育情况相比有明显区别。3头未检测出SRY基因的母牛乳腺发育如图4，更接近于正常母牛的发育特征。而被检测为性染色体嵌合体的9头母牛如图3，符合乳头小，且紧贴腹壁的特征。

通过持续观察，3头未检测出SRY基因的异性孪生母牛均有发情表现，经自然交配后，请兽医进行直肠检查，结果显示，3头母牛中有2头已经怀孕，目前已经有1头母牛于24月龄产下1头公犊。郭彬等［10］报道，在33头异性孪生母牛中留养的6头异性孪生母牛经验证可以怀孕并产犊。该结果表明，经适当方法验证后留用的异性孪生母牛确实可以怀孕并产犊，与本研究结果一致。在被检测为性染色体嵌合体的9头异性孪生母牛中，3头有发情表现，经直肠检查，普遍存在生殖道发育不全，与傅春泉等［11］的实验结果相符，且9头异性孪生母牛均未怀孕。

外部观察及直肠检查的结果均与早期利用PCR技术鉴定异性孪生母牛是否可以留用的结果相符。临床检查、核型分析、血型鉴定、荧光原位杂交等方法都曾被用于异性孪生母牛的鉴定［12］，这些方法有的准确性不高，有的需要长时间的高投入，有的需要公牛和母牛的样品都具备才可以检验，因此这些方法的实用性不强。PCR方法快速准确、简单实用，适合大规模推广应用。早期决定异性孪生母牛的去留可以有效避免不必要的经济损失，因此具有很高的应用价值。

［1］ Kinsel M L，Marsh W F，Ruegg P I，et al.Risk factor of twinning in dairycows［J］.DairySci，1998，81（4）：989-993.

［2］ 刘广振，陈红玲，唐冬生，等.奶牛双胎的发生及其对奶业生产的影响［J］.乳业科学与技术，2006，29（3）：138-140，144.

［3］ 曹德祥，聂旭.异性双生无繁殖力荷斯坦母牛的鉴定［J］.黑龙江动物繁殖，2005（2）：22.

［4］ 祁生旺，呼日查毕力格，田志，等.探棒法诊断奶牛犊先天性生殖器官发育不全［J］.中国兽医杂志，2008（4）：74.

［5］ 张传生，杜立新.哺乳动物性别决定机理及性别鉴定方法研究进展［J］.黄牛杂志，2001，27（3）：38-42.

［6］ 徐如海，蒋永清，胡锦平，等.利用PCR技术检测异性孪生不育母牛［J］.农业生物技术学报，2007，15（1）：28-31.

［7］ Herr C M，Reed K C.Micromanipulation of bovine embryos for sex determination［J］.Theriogenology，1991，35（1）：45-54.

［8］ 宫昌海，马桢，韩春梅，等.异性孪生不育研究进展［J］.草食家畜，2012（4）：37-41，46.

［9］Parkinson T J，Smith K C，Long S E，et al.Interrelationships among gonadotrophins，reproductive steroids and inhibin in freemartin ewes［J］.Reproduction，2001，122（3）：397-409

［10］郭彬，孙长军.购牛要慎防异性孪生母牛［J］.黑龙江动物繁殖，2011，19（6）：54-54.

［11］傅春泉，敬余，张建中，等.奶牛遗传性繁殖障碍疾病的诊断［J］.黑龙江动物繁殖，2005，13（3）：26-27.

［12］Dadula A M.The freemartin syndrome：an update［J］.Animal Reproduction Science，2005，87：93-109.

Identification on the Retained Value of Heterosexual Twin Heifers by PCR Technology

Ji Linbao，YangYongzai，CaoBinghai，et al
（State KeyLaboratoryofAnimal Nutrition，College ofAnimal Science and Technology，China Agricultural University，Beijing100193，China）

In order toidentifythe retained value ofheterosexual twin heifer，SRY gene in the Ychromosome oftwelve heterosexual twin Holstein heifers were determined by PCR Technology.The heterosexual twin heifer with SRY gene is infertile，while the heterosexualtwin heifer without SRY gene is fertile.The results showed that this method was rapid，accurate and helpful.

PCRtechnology；heterosexualtwinheifer；sexchromosomechimerism

S823.2

A

2095-3887（2016）03-0014-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.03.004

2016-02-29

国家肉牛牦牛产业技术体系项目（CARS-38）；南方地区草食家畜育肥与高品质肉生产技术研究项目（201303144）

姬琳堡（1992-），女，硕士研究生。

曹兵海（1963-），教授，博士生导师，主要从事肉牛营养与肉品质研究。