转录因子扭曲基因表达异常在早期子宫颈癌发病中的意义及对预后的影响

宋佳伦，杨 琦

(山东大学附属生殖医院，山东 济南 250000)



转录因子扭曲基因表达异常在早期子宫颈癌发病中的意义及对预后的影响

宋佳伦，杨 琦

(山东大学附属生殖医院，山东 济南 250000)

目的 探讨转录因子扭曲基因(Twist)表达异常在早期子宫颈癌发病中的意义及对预后的影响。方法 选取早期子宫颈癌患者87例，子宫颈上皮内瘤变(CIN)患者43例和正常子宫组织40例，实时荧光定量PCR检测早期子宫颈癌、CIN和正常子宫组织中Twist基因表达，早期子宫颈癌患者术后随访截止2015年5月31日，以早期子宫颈癌组织中Twist mRNA表达量中位值为界值，将患者分为高表达组(n=46)和低表达祖(n=41)，利用Kaplan-Meier生存分析法分析无进展生存时间和生存时间。结果 早期子宫颈癌组织中Twist mRNA相对表达量(2.21±0.17)，高于CINⅡ和CIN Ⅲ组织中的(1.32±0.13)和(1.71±0.15)及正常子宫组织中的(1.06±0.11)，且CINⅢ>CINⅡ>正常子宫组织，差异均有统计学意义(P<0.05)；早期子宫颈癌组织中Twist mRNA相对表达量与临床分期、分化程度、病理类型和淋巴结转移有关(t值分别为27.721、18.047、18.213、19.483，均P<0.05)；低表达组患者中位无进展生存时间49.43个月，高表达组患者中位无进展生存时间37.52个月，Log Rank检验显示差异有统计学意义(χ2=4.350，P=0.037)，低表达组患者中位生存时间53.8个3月，高表达组患者中位生存时间43.91个月，Log Rank检验显示差异有统计学意义(χ2=4.381，P=0.036)。结论 Twist基因在早期子宫颈癌组织中呈高表达，高表达患者术后无进展生存时间和生存时间缩短。

子宫颈癌；转录因子扭曲基因；表达；预后

子宫颈癌作为女性常见恶性肿瘤，具有恶性程度高、侵袭力强、易转移等特点，是第三位导致女性死亡的恶性肿瘤[1]。目前，该病发病机制尚未完全清楚。转录因子扭曲基因(twisted gene transcription factor，Twist)作为一种转录因子，在胚胎发生过程中发挥关键性调控作用，具有癌基因的特质，可通过调控死亡相关基因表达及上皮-间质转化而调节肿瘤转移及侵袭过程[2]。研究表明，Twist与多种肿瘤生长、增殖、侵袭转移、耐药等过程关系密切[3-4]。本研究尝试利用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术分析Twist在早期子宫颈癌组织中表达，以及其与临床病理特征之间的关系，利用生存分析法探讨其与患者预后的关系，以期为临床实践提供基础资料。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2010年4月至2012年5月在山东大学附属生殖医院择期行手术治疗的早期子宫颈癌患者87例，年龄28～74岁，平均年龄(49.32±8.93)岁，根据国际妇产科联合会(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)2009年临床分期标准：Ⅰa期5例，Ⅰb期54例，Ⅱa期28例；分化程度：低分化16例，中分化59例，高分化12例；病理类型：鳞癌72例，腺癌15例；伴有淋巴结转移14例。同期，选取在我院行宫颈锥切术治疗的子宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)患者43例，年龄27～75岁，平均年龄(50.84±9.31)岁，包括CIN Ⅱ 17例和CINⅢ26例；留取子宫肌瘤行子宫全切术患者正常子宫组织40例作为对照组，年龄27～73岁，平均年龄(48.82±8.71)岁。所有研究对象术前均未接受放化疗治疗，排除其他子宫肿瘤者。所有研究对象均留取子宫颈组织，保存于-70℃冰箱以备检。本研究通过医院伦理委员会批准，所有研究对象均行知情同意。

1.2方法

1.2.1主要试剂及器材

Trizol总RNA提取试剂盒购自美国Biomiga公司，逆转录试剂盒和PCR反应试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司，Twist及内参引物序列均由上海生工生物公司设计合成，紫外分光光度计购自上海凤凰光学科仪有限公司，实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2.2实时荧光定量PCR检测早期子宫颈癌、子宫颈上皮内瘤变和正常子宫组织中转录因子扭曲基因表达

取保存的子宫颈组织，研磨后，用细胞裂解液进行裂解，用Trizol总RNA提取试剂盒对总RNA进行提取，用紫外分光光度计对获得的总RNA进行检测，取A260/A280≥1.80样本完成后续实验操作。利用逆转录试剂盒进行逆转录获得cDNA模板单链，以cDNA为模板用PCR反应试剂盒进行PCR。Twist及内参引物序列分别为：Twist引物：上游：5′-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3′，下游：5′-TCTGGAGGACC￣TGGTAGAGG-3′；GAPDH引物,上游：5′-GGGAAACTGT￣GGCGTGAT-3′，下游：5′-GTGGTCGTTGATTTCAAT-3′。PCR反应条件：94℃ 60s，94℃ 30s，56℃ 20s，74℃ 15s，连续进行40个循环。每个样品均设置3个反应复孔。以GAPDH为参照，用2-△△Ct法获得不同组织中Twist mRNA相对表达量。

1.2.3病例随访

所有早期子宫颈癌入选患者均完成随访，随访形式包括门诊和电话随访，平均每3个月随访一次，未出现失访病例，随访截止2015年5月31日，以术后病情进展、恶化或复发为终点事件，记录无进展生存时间，以死亡为终点时间，记录生存时间。

1.3统计学方法

2结果

2.1早期子宫颈癌、子宫颈上皮内瘤变和正常子宫组织中转录因子扭曲基因表达

早期子宫颈癌组织中Twist mRNA相对表达量(2.21±0.17)，高于CINⅡ和CIN Ⅲ组织中的(1.32±0.13)和(1.71±0.15)及正常子宫组织中的(1.06±0.11)，CIN Ⅲ和CINⅡ均高于正常子宫组织，且CIN Ⅲ高于CINⅡ，差异均有统计学意义(F=69.835，P<0.05)，见图1。

图1 早期子宫颈癌、CIN和正常子宫组织中Twist基因表达

Fig.1 Expressions of Twist gene in early stage cervical cancer, CIN and normal tissues

2.2早期子宫颈癌组织中转录因子扭曲基因表达与临床病理特征之间的关系

早期子宫颈癌组织中Twist mRNA相对表达量与年龄无关(P>0.05)，而与临床分期、分化程度、病理类型和淋巴结转移有关(t值分别为27.721、18.047、18.213、19.483，均P<0.05)，见表1。

注：与Ⅰa相比，*P<0.05；与Ⅰb相比，#P<0.05。

2.3早期子宫颈癌组织中转录因子扭曲基因表达对无进展生存时间和生存时间的影响

以早期子宫颈癌组织中转录因子扭曲基因 mRNA相对表达量中位值为界值，将患者分为高表达组(n=46)和低表达祖(n=41)，低表达组患者中位无进展生存时间49.43个月，高表达组患者中位无进展生存时间37.52个月，Log Rank检验显示差异有统计学意义(χ2=4.350，P=0.037)，见图2；低表达组患者中位生存时间53.83个月，高表达组患者中位生存时间43.91个月，Log Rank检验显示差异有统计学意义(χ2=4.381，P=0.036)，见图3。

图2 早期子宫颈癌组织中Twist基因表达对无进展生存时间的影响

Fig.2 Influence of the expressions of Twist gene in early-stage cervical cancer tissues on progression-free survival time

图3 早期子宫颈癌组织中Twist基因表达对生存时间的影响

Fig.3 Influence of the expressions of Twist gene in early-stage cervical cancer tissues on survival time

3讨论

3.1转录因子扭曲基因可能与早期子宫颈癌发病有关

随着诊疗技术的进展，子宫颈癌早期阶段便可诊断发现，有效的手术治疗极大的改善了患者预后及术后生活质量[5-6]。但对患者治疗后随访发现，子宫颈癌患者术后具有较高的复发率，且随着复发、病情进展恶化，死亡率随之升高，不利于患者预后[7]。因此，对影响早期子宫颈癌患者术后复发的相关机制开展研究，对改善患者预后具有重要意义。Twist作为高度保守的转录因子，在胚胎发育过程中的细胞重建中发挥重要调控作用，近年来发现，其在肿瘤细胞增殖、分化、侵袭、转移过程中发挥关键性调节作用[8]。有研究指出，Twist可能通过上皮-间质转化而使细胞失去极性，失去了与基底膜连接，而加速细胞侵袭与迁移过程[9]。Twist在多种恶性肿瘤组织中呈高表达，作为一个癌基因而参与肿瘤进展及细胞侵袭、转移过程[10]。本研究显示，Twist基因在早期子宫颈癌和CIN组织中均出现不同程度表达，且早期子宫颈癌> CIN Ⅲ>CINⅡ>正常子宫组织，说明Twist基因随着子宫颈病变严重程度而表达增加，可能与早期子宫颈癌发病有关，在子宫颈癌发病中发挥癌基因作用。

3.2转录因子扭曲基因表达水平可作为子宫颈癌患者预后的预测指标

本研究显示，早期子宫颈癌组织中Twist mRNA相对表达量与临床分期、分化程度、病理类型和淋巴结转移有关(P<0.05)，进一步说明Twist可能与早期子宫颈癌病情严重程度及侵袭、转移有关，与丁娅妮等[11]研究结论相同。有研究指出，Twist在卵巢上皮性癌中呈高表达，且高表达患者无进展生存时间及总生存时间均缩短[12]。本研究显示，以早期子宫颈癌组织中Twist mRNA相对表达量中位值为界值，高表达组患者中位无进展生存时间和中位生存时间均短于低表达组患者，说明Twist基因表达与早期子宫颈癌患者预后有关，Twist基因高表达预示患者预后不良，与Wang等[13]研究结论相同，提示Twist基因表达水平可作为子宫颈癌患者预后的预测指标。

综上所述，Twist基因在早期子宫颈癌组织中呈高表达，与子宫颈癌发生、进展、转移过程密切相关，且Twist基因高表达患者术后无进展生存时间和生存时间缩短，为下一步开展基因治疗以改善患者预后提供了新的靶位。

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[专业责任编辑：任慕兰]

Significance of abnormal expression of twisted gene transcription factor in pathogenesis of early-stage cervical cancer and its influence on prognosis

SONG Jia-lun,YANG Qi

(Affiliated Reproductive Hospital of Shandong University, Shandong Jinan 250000, China)

Objective To investigate the significance of abnormal expression of twisted gene transcription factor (Twist) in pathogenesis of early-stage cervical cancer and its influence on prognosis. Methods Totally 87 cases of early-stage cervical cancer, 43 cases of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and 40 cases of normal uterine tissues were selected. The expressions of Twist gene in early-stage cervical cancer, CIN and normal tissues were detected by using real-time PCR. All patients with early-stage cervical cancer were postoperatively followed up till May 31, 2015. Taking the median of Twist mRNA expression level in early-stage cervical cancer tissues as cutoff value, the patients were divided into high expression group (n=46) and low expression group (n=41). The progression-free survival time and survival time were analyzed by using Kaplan-Meier survival analysis.Results The relative expression levels in early-stage cervical cancer tissues was 2.21±0.17, which was higher than that in CINⅡ and CIN Ⅲ tissues(1.32±0.13, 1.71±0.15) and that in normal uterine tissue (1.06±0.11). And it was higher in CIN Ⅲ than in CINⅡand than in normal uterine tissue with statistically significant differences (P<0.05). The relative expression levels of Twist mRNA in early-stage cervical cancer tissues were related with clinical stage, degree of differentiation, histological type and lymph node metastasis (tvalue was 27.721, 18.047, 18.213 and 19.483, respectively, allP<0.05). The median progression-free survival time in low expression group was 49.43 months, and in high expression group it was 37.52 months. Log Rank test showed significant difference (χ2=4.350,P=0.037). The median survival time in low expression group was 53.83 months, and in high expression group it was 43.91 months. Log Rank test showed significant difference (χ2=4.381,P=0.036). Conclusion Twist gene is highly expressed in early-stage cervical cancer tissue. The progression-free survival time and survival time of high expression patients after surgery are shortened.

cervical cancer; twisted gene transcription factor (Twist); expression; prognosis

2016-05-13

河南省2014科技发展计划资助项目(编号：142102310416)

宋佳伦(1978 -)，女，主治医师，硕士，主要从事妇产科工作。

杨 琦，副主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.09.012

R711.7

A

1673-5293(2016)09-1066-03