p53、p16、PTEN、Ki-67、p63在子宫内膜腺癌中的表达及其与预后的相关性

陈丽君，任晓丽，孙秀利，王映梅，徐婉妮，陈良凤，王 建

(1.第四军医大学西京医院妇产科，陕西 西安 710032；2.富平县医院妇产科，陕西 渭南 711700)



p53、p16、PTEN、Ki-67、p63在子宫内膜腺癌中的表达及其与预后的相关性

陈丽君1，2，任晓丽1，孙秀利1，王映梅1，徐婉妮1，陈良凤1，王 建1

(1.第四军医大学西京医院妇产科，陕西 西安 710032；2.富平县医院妇产科，陕西 渭南 711700)

目的 探讨p53、p16、PTEN、Ki-67、p63在子宫内膜腺癌组织中的表达及其与临床预后的相关性，并分析这些基因在腺癌中表达间的相关性。方法 采用免疫组化S-P法检测2001年1月至2015年11月西京医院收治的782例子宫内膜腺癌患者的癌组织石蜡标本中p53、p16、PTEN、Ki-67、p63的蛋白表达情况。结果 ①p53、p16 、PTEN、Ki-67、p63在子宫内膜腺癌组织中的阳性表达率分别为61.9%，76.2%，10.9%，54.2%，19.6%；②p53与临床分期、组织分化、脉管瘤栓形成、死亡有关，均P<0.000；③p16与组织分化、脉管瘤栓形成、复发及死亡有关，P值分别为：0.003、0.023、0.000、0.000；④PTEN与组织分化、脉管瘤栓形成、死亡有关，P值分别为：0.000、0.000、0.007；⑤Ki-67与临床分期、肌层浸润、组织分化、复发及死亡有关，P值分别为：0.000、0.000、0.043、0.000；⑥p63与组织分化、脉管瘤栓形成、复发有关，P值分别为：0.000、0.000、0.042(均P<0.05)；⑦p53与p16、Ki-67、p63的表达呈正相关，相关系数分别为0.087、0.103、0.128(均P<0.05)；⑧p16与PTEN、Ki-67、p63的表达呈正相关，相关系数分别为0.079、0.071、0.245(均P<0.05)；⑨PTEN与p63的表达呈正相关，相关系数为0.242(P<0.05)。结论 p53、p16、PTEN、Ki-67、P63基因在子宫内膜腺癌中的表达存在明显相关性，它们在子宫内膜癌的发生、进展及影响其预后中可能起协同促进作用，联合检测这些基因表达可能更确切地反应肿瘤进展的动态改变，对判断子宫内膜腺癌恶性程度及评估预后有一定的参考价值。

p53；p16；PTEN；Ki-67；P63；子宫内膜腺癌；免疫组织化学

子宫内膜癌(endometrial carcinoma, EC)是发病率仅次于宫颈癌的女性生殖系统第二大恶性肿瘤，以子宫内膜样腺癌(endometrial adenocarcinoma, EA)最常见，近年来流行病学研究发现，在全球范围内子宫内膜癌的发病率呈现上升趋势，美国发病率最高，据统计，2014年美国新发子宫内膜癌52 630例，死亡8 590例[1]，亚洲发病率相对较低，但近年来其发病率也明显增加，且发病年龄趋于年轻化[2]，严重危害女性身体健康。现代分子生物学研究发现，原癌基因激活、抑癌基因失活或突变、抗凋亡基因过度表达在子宫内膜癌的发生发展中起着重要作用，与子宫内膜腺癌有关的原癌基因Ki-67，抑癌基因p53，p16，p63，PTEN也备受关注。本研究搜集西京医院782例子宫内膜腺癌患者的完整病例资料，采用免疫组织化学技术检测p53、p16、PTEN、Ki-67、p63在子宫内膜腺癌肿瘤细胞中的蛋白表达情况，探讨其与子宫内膜腺癌临床病理特征及预后的相关性，并分析这些基因在腺癌中表达间的相关性，为判断子宫内膜腺癌的恶性程度及评估预后提供实验依据，可能对子宫内膜腺癌的治疗有一定的指导意义。

1资料与方法

1.1一般资料

选取西京医院2001年1月至2015年5月手术切除且资料完整的子宫内膜腺癌患者的组织石蜡标本782例，通过电话随访到590例，所有患者术前均经诊断性刮宫确诊，均未行放疗、化疗和激素治疗，术后病理组织学诊断均为子宫内膜腺癌。手术病理分期采用2009年5月国际妇产科联盟(FIGO)重新修订的标准进行分期：Ⅰ期661例，Ⅱ期88例，Ⅲ期30例，Ⅳ期3例；肌层浸润深度：<1/2肌层360例，≥1/2肌层422例；组织分化：高分化488，中分化236例，低分化58例；脉管瘤栓形成29例；预后：复发69例，死亡54例。

1.2随访调查

在治疗结束6个月后，通过电话及返院复查进行随访调查，并对患者临床资料进行收集、整理。分析患者影像学检查结果、血清肿瘤标记物CA125、有无胸水或腹水等。随访终止： ①死亡；②存活者随访截止日期2015年05月。

1.3试剂

野生型p53、p16、PTEN、Ki-67、p63抗体均由abcam,UK提供。

1.4方法

手术切除的所有标本均用10%福尔马林液固定，石蜡包埋处理，切片厚度为4μm连续切片，免疫组化采用SP法，操作步骤严格按试剂盒说明进行。

1.5免疫组化结果判定

野生型p53、PTEN、Ki-67、p63阳性表达均为细胞核着色，胞核被染成棕黄色。p16染色主要定位于胞浆、胞核，以细胞核和(或) 细胞质出现棕黄色颗粒为阳性。高倍镜下计数阳性细胞占全部肿瘤细胞数目的百分比，随机选取10个高倍视野取平均数，阳性细胞数>10%为阳性结果。结果判定综合标本中阳性细胞百分比和阳性细胞染色强度两项指标，采用半定量积分法判定：①根据染色强度评分：无染色为0分，浅黄色为 1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；②根据阳性染色细胞的数量占全部肿瘤细胞数量的百分比评分：≤10%为1分，10%～50%为 2分，50%～75%为3分，>75%为4分；③两项指标评分相乘，0～3 分为阴性，3～6 分为 +，6～8分为++，8～12分为+++。所有病理切片均由两位资深的病理医师进行双盲观察。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法，相关性分析采用Spearman等级相关分析法。当P<0.05表明差异有统计学意义。

2结果

2.1 p53、p16、PTEN、Ki-67、p63的表达与子宫内膜腺癌临床病理特征的关系

野生型p53在子宫内膜腺癌组织中的阳性表达率为61.9%；并与临床分期、组织分化、脉管瘤栓形成有关(P<0.05)，但与肌层浸润无关(P>0.05)；

Ki-67在子宫内膜腺癌组织中的阳性表达率为54.2%；其与临床分期、肌层浸润、组织分化有关(P<0.05)，与脉管瘤栓形成无关(P>0.05)；

p16、PTEN及p63在子宫内膜腺癌组织中的阳性表达率分别为76.2%、10.9%及19.6%；它们与组织分化、脉管瘤栓形成有关(P<0.05)，而与临床分期、肌层浸润无关(P>0.05)，见表1。

表1 p53、p16、PTEN、Ki-67、p63的表达与子宫内膜腺癌临床病理特征的关系[n(%)]

注：*表示采用Fisher检验。

2.2 p53、p16、PTEN、Ki-67、p63表达的相关性

p53与p16、Ki-67、p63的表达呈正相关，相关系数分别为0.087，0.103，0.128(P<0.05)；p16与PTEN、Ki-67、p63的表达呈正相关，相关系数分别为0.079、0.071、0.245(均P<0.05)；PTEN与p63的表达呈正相关，相关系数为0.242(P<0.05)，见表2。

2.3 p53、p16、PTEN、Ki-67、p63的表达与子宫内膜腺癌临床预后的关系

选取西京医院子宫内膜癌患者782例，随访590 例，失访192例，随访率为75.5% ，其中存活536例，复发69例，死亡54 例，复发率为11.7%，存活率为90.8%，死亡率为9.2%。

野生型p53、PTEN的蛋白表达与术后复发无关(P>0.05)，与死亡有关(P<0.05)；p16、Ki-67的蛋白表达与术后复发及死亡均有关(P<0.05)；p63与术后复发有关(P<0.05)，与死亡无关(P>0.05)，见表3。

表2 p53、p16、PTEN、Ki-67、p63表达的相关性

Table 2 The correlation among the expressions of p53,p16, PTEN, Ki-67 and p63

表3 p53、p16、PTEN、Ki-67、p63的表达与子宫内膜癌患者预后的关系 [n(%)]

注：*表示采用Fisher检验。

3讨论

近年来我国子宫内膜癌的发病率逐渐升高，且其发病呈年轻化趋势。多种原癌基因及抑癌基因在子宫内膜癌的发生发展中起着非常重要的作用并影响其预后。因此，及时对高危子宫内膜癌患者进行检查，精准子宫内膜癌的病理检查，找出能确切反应EC进展的动态改变生物学指标，可能更有助于EC的早期诊断、病情评估及判断预后，为EC的个体化治疗提供实验依据，进而提高EC的治愈率并降低其死亡率[3-4]。本研究结果显示：p53、p16、PTEN、Ki-67、p63 表达与子宫内膜腺癌的临床病理分期及预后密切相关，且这些基因表达间存在一定的相关性，联合检测这些基因可能对评估子宫内膜腺癌恶性程度、进展及预后等具有一定的指导意义。

3.1 p53与子宫内膜腺癌的关系

p53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因，野生型p53是一种抑癌基因兼凋亡诱导基因[5]。p53基因突变后编码的蛋白失去功能，表现为癌基因形态，并抑制野生型p53表达，进而诱导肿瘤发生。本研究结果显示，野生型 p53 的阳性表达率为 61.9%，且与EC的临床分期、 组织分化、 脉管瘤栓形成及死亡有关(P<0.05)。 这与既往研究结果一致。因此，p53可作为评估子宫内膜癌侵袭进展及预后的肿瘤标志物。

3.2 p16与子宫内膜腺癌的关系

p16基因又称细胞周期依赖性激酶(CDK)抑制基因(cyclin-Dependent Kinaseinhibitor-2A，CDKN2A)，其表达产物p16蛋白是CDK4和CDK6的抑制剂，对细胞周期起负调控作用，抑制细胞过度增殖及恶变。但p16基因缺失、突变及启动子高甲基化可引起Cyclin D1-CDK4/6-pRb-E2F通路调节功能失控，导致细胞过度增殖，诱发肿瘤[6]。p16蛋白甲基化可使癌细胞不断增殖，最终发展为癌，尤其在子宫内膜癌的转移中起着关键性的作用。Ignatov等[7]的研究显示，子宫内膜癌伴转移的患者pl6INK4a失活率高达93.3%，其子宫内膜癌临床病理分期无明显相关性，但与转移的发生率呈显著正相关性。Engelson等[8]发现p16正常表达患者的5年生存率为85%，而p16表达增加者下降至50%，p16表达可能作为判断EC预后的指标。但Ignatov等[9]的研究结果并没有发现p16表达与5年生存有关。本实验结果表明，子宫内膜腺癌中p16蛋白阳性表达率为76.2%,，其不同表达与腺癌的组织分化、脉管瘤栓形成、复发及死亡有关(P<0.05)，与临床分期、肌层浸润无关(P>0.05)；p16阳性表达率越高，复发及死亡率越高，预后越差，与国外研究结果一致。

3.3 PTEN与子宫内膜腺癌的关系

PTEN是一种肿瘤抑制基因，能抑制细胞生长，诱导凋亡。PTEN主要通过拮抗磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB)信号传导通路，抑制细胞有丝分裂，诱导细胞凋亡，或使细胞周期停滞于G1期，对细胞的生长起负调控作用，从而抑制肿瘤的发生[10]。当PTEN基因发生突变、缺失及甲基化时，可导致细胞持续增殖引发肿瘤。目前关于PTEN蛋白的表达与子宫内膜癌的临床病理特征及预后的相关性尚无定论。有研究显示，PTEN的表达与子宫内膜癌患者的临床分期、肌层浸润程度、 年龄及肿瘤大小无相关性[11]。而也有研究认为PTEN基因突变与子宫内膜腺癌的发生、临床分期及浸润转移有关，为预后不良的高危因素[12-13]。本研究显示，子宫内膜腺癌中PTEN的阳性表达率为10.9%，其不同表达与腺癌的组织分化、脉管瘤栓形成有关(P<0.05)，且其阳性表达率越高，死亡率越高，预后越差，这与多数国外研究结果一致。

3.4 Ki-67与子宫内膜腺癌的关系

Ki-67是一种核增殖标志基因，反应细胞的增殖状态，是目前检测肿瘤细胞增殖活性最可靠的指标，可作为判断肿瘤恶性程度及预后的生物学标志物。有研究显示，Ki-67和子宫内膜癌的临床分期、浸润深度及预后关系密切[14]；Ki-67高表达EC者肿瘤级别较高，预后较差。Nielsen等(1996年)研究报道Ki-67与子宫内膜癌的临床分期、浸润深度、复发及转移无明显相关性。

本研究中Ki-67表达阳性率为54.2%,，其表达与腺癌的临床分期、肌层浸润、组织分化、复发及死亡呈正相关，Ki-67阳性表达率越高，复发率及死亡率越高，预后越差。

3.5 p63与子宫内膜腺癌的关系

p63属p53家族成员，与p53是同源基因，但p63很少发生突变。p63 可以产生两类蛋白亚型：一类具有反式激活域、氨基端全长的TAp63亚型 ；另一类是氨基端截短的△Np63 亚型。TAp63亚型可以激活p53的相关靶基因，参与p53介导的细胞信号转导通路，使细胞周期停滞并诱导细胞凋亡；而△Np63缺乏TA区域，不能诱导转录，丧失了反式激活p53靶基因的功能，但△Np63保留了DNA结合区，能竞争DNA结合位点或直接与p53或TAp63 结合使之失活，促进细胞增殖并抑制凋亡，具有潜在的癌基因功能。目前国内外对p63和子宫内膜腺癌的研究不多，有对p63在正常子宫内膜，增生性内膜及内膜癌中进行对比研究发现，p63表达缺失在子宫内膜癌显著升高[15]。本研究中p63的阳性表达率为19.6%；其不同表达与腺癌的组织分化、脉管瘤栓形成、复发有关(P<0.05)，与临床分期、肌层浸润、死亡无关(P>0.05)。p63阳性表达率越高，复发率越高，预后越差，由此说明 p63 可能起癌基因的作用，能促进子宫内膜腺癌的发生、发展并影响其预后。

3.6 p53、p16、PTEN、Ki-67、p63 在子宫内膜腺癌中的表达相关性

很多学者认为肿瘤的发生是多因素、多基因协同作用的结果，所以联合检测与某种肿瘤相关的多种基因表达对判断肿瘤的进展及预后有重要作用。参与EC发生、发展的很多相关因子之间可能存在密切的内在联系，目前关于 p53、p16、PTEN、Ki-67、p63 在 EC 中的联合检测研究甚少。本研究结果显示，p53与p16、Ki-67、p63的表达呈正相关，相关系数分别为0.087、0.103、0.128(均P<0.05)；p16与PTEN、Ki-67、P63的表达呈正相关，相关系数分别为0.079、0.071、0.245(均P<0.05)；PTEN与P63的表达呈正相关，相关系数为0.242(P<0.05)，提示它们在子宫内膜腺癌的发生、发展、浸润以及复发、死亡过程中是互相影响并协同作用的。

总之，临床中在做免疫组化检测分析时，多因子联合检测可弥补单一检测敏感性差、准确率低的缺点，提高EC进展及判断预后的灵敏度，可能更确切可靠地反应EC演化和进展的动态改变过程，并可能对监测 EC 进展、判断恶性程度及评估患者预后和治疗有一定的指导意义。

[1]Siegel R, Ma J, Zou Z,etal. Cancer statistics, 2014[J]. CA Cancer J Clin,2014,64(1):9-29.

[2]Stewart C J,Doherty D A,Havlat M,etal. Transtubal spread of endometrial carcinoma: correlation of intra-luminal tumour cells with tumour grade, peritoneal fluid cytology, and extra-uterine metastasis[J].Pathology,2013,45( 4) :382-387.

[3]Dowsett M, Nielsen T O, A'Hern R,etal. Assessment of Ki67in breast cancer: Recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group[J].J Natl Cancer Inst,2011,103(22): 1656-1664．

[4]Chaudhry P, Asselin E. Resistance to chemotherapy and hormone therapy inendometrial cancer[J].Endocr Relat Cancer,2009,16(2): 363-380.

[5]Attias-Geva Z, Bentov I, Kidron D,etal. p53 Regulates insulin-like growth factor-I receptor gene expression in uterine serous carcinoma and predicts responsiveness to an insulin-like growth factor-I receptor-directed targeted therapy[J].Eur J Cancer，2012，48(10):1570-1580.

[6]Khoo C M, Carrasco D R, Bosenberg M W,etal. INK4a/Arf tumor suppressor does not modulate the degenerative conditions or tumor spectrum of the telomerase-deficient mouse[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(10):3931-3936.

[7]Ignatov A, Bischoff J, Schwarzenau C,etal. p16 alterations increase the metastatic potential of endometrial carcinoma[J]. Gynecol Oncol,2008,111(2):365-371.

[8]Engelsen I B, Stefansson I, Akslen L A,etal. Pathologic expression of p53 or p16 in preoperative curettage specimens identifies high-risk endometrial carcinomas[J].Am J Obstet Gynecol,2006 ,195(4):979-986.

[9]Ignatov A, Bischoff J, Schwarzenau C,etal. p16 alterations increase the metastatic potential of endometrial carcinoma[J].Gynecol Oncol, 2008,111:365-371.

[10]Shen W H，Balajee A S，Wang J，etal.Essential role for nuclear PTEN in maintaining chromosomal integrity[J].Cell,2007,128 (1):157-170.

[11]梁艳芳, 曾今诚, 康东平 等.PTEN、p27 和 BAG-1 在子宫内膜癌中的表达及临床意义[J].重庆医学, 2014, 43(7):785-787.

[12]蒋宋薇,徐红,梁秀就,等.子宫内膜癌组织PTEN和c-erbB-2蛋白表达临床意义的探讨[J].中华肿瘤防治杂志,2009,16(16):1246-1249.

[13]Athanassiadou P, Athanassiades P, Grapsa D,etal. The prognostic value of PTEN, p53, and beta catenin in endometrial carcinoma:a prospective immunocytochemical study[J].Int J Gyneol Cancer,2007,17(3):697-704.

[14]Stefansson I M, Salvesen H B, Immervoll H,etal. Prognostic impact of histological grade and vascular invasion compared with tumour cell proliferation in endometrial carcinoma of endometrioid type[J]. Histopathology,2004, 44(5):472-479.

[15]Stefansson I M, Salvesen H B, Akslen L A. Loss of p63 and cytokeratin 5/6 expression is associated with more aggressive tumors in endometrial carcinoma patients[J]. Int J Cancer,2006,118(5):1227-1233.

[专业责任编辑： 安瑞芳]

Expressions of p53, p16, PTEN, Ki-67and p63 in endometrial adenocarcinoma and their correlation with prognosis

CHEN Li-jun1，2,REN Xiao-li2,SUN Xiu-li1, WANG Ying-mei1, XU Wan-ni1, CHEN Liang-feng1, WANG Jian1

(1. Department of Gynecology and Obstetrics, Xijin Hospital, The Fourth Military Medical University, Shaanxi Xi’an 710032, China;2. Department of Gynecology and Obstetrics, Fuping Hospital, Shaanxi Weinan 711700, China)

Objective To investigate the expressions of p53, p16, PTEN, Ki-67 and p63 in endometrial adenocarcinoma (EA) and their correlation with clinical prognosis, and to analyze the correlation among expressions of these genes. Methods Totally 782 cases of EA who sought medical advice at Xijing Hospital during the period of 2001-2015 were included. Immunohistochemical SP method was applied to detect the expression of paraffin specimens in cancer tissues of these cases. Results The positive expression rates of p53, p16, PTEN, Ki-67 and p63 were 61.9%, 76.2%, 10.9%, 54.2% and 19.6%, respectively in EA. The expression of p53 was correlated with clinical stage, histologic classification, vascular tumor thrombus and death ( allP<0.000), and the expression of p16 was correlated with histologic classification, vascular tumor thrombus, recurrence and death (Pvalue was 0.003, 0.023, 0.000 and 0.000, respectively). The expression of PTEN was correlated with histologic classification, vascular tumor thrombus and death (Pvalue was 0.000, 0.000 and 0.007, respectively), and the expression of Ki-67 was related to clinical stage, muscle invasion, histologic classification, recurrence and death (Pvalue was 0.000, 0.000, 0.043 and 0.000, respectively). The expression of p63 was related to histologic classification, vascular tumor thrombus and recurrence (Pvalue was 0.000, 0.000 and 0.042, respectively) (allP<0.05). The expression of p53 was positively correlated with the expressions of p16, Ki-67 and p63, and the coefficient was 0.087, 0.103 and 0.128, respectively(allP<0.05). The expression of p16 was positively correlated with PTEN, Ki-67 and p63, and the coefficient was 0.079, 0.071 and 0.245(P<0.05). PTEN was positively related to p63 in expression with the coefficient of 0.242 (P<0.05). Conclusion Expressions of p53, p16, PTEN, Ki-67 and p63 are significantly correlated in EA. They have significantly interactive impacts on the development of EA. The combined detection of expressions of them can accurately reflect the dynamic change of cancer progression, which provides certain reference for judging the degree of malignancy and evaluating prognosis.

p53; p16; PTEN; Ki-67; p63; endometrial adenocarcinoma (EA); immunohistochemistry

2016-08-01

陈丽君(1980-)，女，主治医师，主要从事妇科疾病的诊疗工作。

王 建，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.09.044

R737.33

A

1673-5293(2016)09-1157-04