CD105和ki67在人卵巢癌细胞中的表达并确定表达部位

郭海荣，李增山，贺 帅，王小燕，刘 萍



CD105和ki67在人卵巢癌细胞中的表达并确定表达部位

郭海荣1，李增山2，贺 帅3，王小燕1，刘 萍1

(1.内蒙古医科大学第三附属医院，内蒙古 包头014010；2.第四军医大学基础部病理学教研室，陕西 西安710032；3.包头医学院基础医学与法医学院病理学教研室，内蒙古 包头014060)

目的 检测CD105和Ki67在人卵巢癌细胞中的表达情况及确定其表达部位。方法 采用Western blot筛选出6种人卵巢癌细胞系中CD105和Ki67均高表达的细胞系；并用免疫荧光染色法明确CD105和Ki67在细胞内的表达部位。结果 CD105和Ki67在人卵巢癌OVCAR3细胞中均高表达；CD105主要表达于OVCAR3细胞的细胞质和细胞膜，Ki67主要表达于OVCAR3细胞的细胞核。结论 人卵巢癌OVCAR3细胞中CD105和ki67均呈高表达，CD105定位于细胞质和细胞膜，ki67定位于细胞核，为进一步研究CD105和ki67在卵巢癌发生发展中的作用机制奠定基础。

CD105；ki67；OVCAR3；Western blot；免疫荧光染色

卵巢上皮癌(ovarian epithelial carcinoma，EOC)是死亡率最高的妇科恶性肿瘤[1]，发生于盆腔深部，表面没有包膜，容易发生转移及种植，大多数卵巢癌患者发现时即是晚期，因此，寻找敏感的肿瘤标志物，早期发现肿瘤，是目前卵巢癌研究领域的热点。所有肿瘤细胞的侵袭和转移均离不开新生的毛细血管，CD105参与了新生毛细血管的形成，是目前有效的毛细血管标记物[2]，能很好的反映毛细血管的生长。Ki67是反映肿瘤细胞增殖的因子，其高表达与恶性肿瘤的分化、侵袭及预后密切相关[3]。以往关于CD105和Ki67在卵巢癌中的研究多局限于组织水平，本文以人卵巢癌细胞为研究对象，研究CD105和Ki67在体外培养的人卵巢癌细胞系中的表达情况及定位，为进一步研究CD105和ki67对卵巢上皮癌细胞增殖、凋亡等生物学活性的影响奠定基础。

1材料和方法

1.1材料及主要试剂

人上皮性卵巢癌细胞系OVCAR3、SKOV3TRp2、HIO-180和ES2购自中科院上海细胞库；人上皮性卵巢癌细胞系HeyA8MDR和A2780ip2购自美国组织培养采集中心；RPMI1640培养基(Gibco-BRL)、胎牛血淸(Gaithersburg，MD)、硫酸链霉素/氨苄青霉素(Gaithersburg, MD)、兔抗人CD105单克隆抗体(abcam cambridge，UK)、鼠抗人Ki67单克隆抗体(abcam，cambridge，UK)、鼠抗人β-actin单克隆抗体(abcam cambridge，UK)、Western Blot抗兔二抗、抗鼠二抗购自武汉晟亚生物技术有限公司。PVDF 膜(millipore NY，USA)荧光抗鼠、抗兔二抗(invitrogen NY，USA)，Hoechst33258 染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞的培养

OVCAR3、HeyA8MDR、SKOV3TRp2、A2780ip2、HIO-180及ES2卵巢癌细胞常规培养于RPMI-1640培养基中(FBS浓度为20%，青霉素和链霉素各100ng/mL)，置37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中，每隔48h换液1次，待细胞生长完全融合后，按照1:3的比例传代或冻存。

1.2.2Western Blot方法检测各细胞内CD105、Ki67蛋白的表达

将已完全融合的6孔板细胞置于冰上，每孔加入2×loading buffer 100μL，混匀，细胞刮反复刮下贴壁细胞移至Ep管内，超声破碎仪裂解细胞，100℃加热10min，分装，-20℃保存备用。取蛋白样品，6%、8%SDS-PAGE电泳分离并转移至PVDF膜，将标记好正反面的PVDF膜在脱脂奶粉中封闭30min，PBST清洗3×5min，在正面加一抗，4℃过夜；PBST清洗后在PVDF膜正面加二抗，37℃1h，洗完膜后按1:1加入发光A、B液，均匀滴于滤膜上，作用5min。在暗室中操作X光片压片、曝光、显影、定影。

1.2.3细胞免疫荧光方法检测CD105、Ki67均高表达人卵巢癌细胞中具体表达部位

将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5 min，室温18℃～26℃过夜干燥后置入6孔板，将完全融合的细胞用0.25%胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，待细胞达30%～50%融合后，取出玻片，1×PBS洗涤3次，每次5min，4%多聚甲醛固定15min，1%Triton X-100行破膜处理10min，1×PBS洗涤3次，每次5min，用含5%羊血清的BSA室温下封闭30min，一抗孵育，4℃过夜，FITC标记的二抗孵育37℃、黑暗环境2h ，Hoechst33258核染色3min，封片，黑暗环境中在荧光显微镜下观察。CD105、Ki67的一抗分别按照1:300、1:200稀释。根据实验需要选用相应FITc(红色或绿色荧光)标记的二抗，按1:500稀释，对每张染色片均另外各取2张作阴性对照，分别不加一抗和不加一抗及二抗，以PBS代替。

2结果

2.1Western Blot检测实验结果

采用Western blot方法分别检测这6种人卵巢癌细胞系中CD105、Ki67的蛋白表达水平的情况，结果发现：选取的6种癌细胞中只有OVCAR3细胞中CD105、Ki67均呈高表达,见图1。

图1 6种人卵巢癌细胞系中CD105、Ki67蛋白表达情况

Fig.1 The protein expressions of CD105 and Ki67 in six ovarian cancer cell lines

2.2免疫荧光检测人卵巢癌OVCAR-3细胞中CD105、Ki67的表达部位

以往研究发现，CD105蛋白主要定位于细胞浆，Ki67蛋白则主要定位于细胞核内。通过第一步实验可以得知：在选取的6种人卵巢癌细胞中，只有OVCAR3细胞中CD105、Ki67蛋白均呈高表达，为进一步验证这两种蛋白在人卵巢癌OVCAR3细胞的表达及分布情况，应用细胞免疫荧光技术检测，检测结果见图2所示：荧光显微镜下可以清晰看到的红色荧光，表明细胞与Cy3(红色)荧光标记的抗CD105抗体结合，与Hoechst33258染核的蓝色荧光组成一个完整的细胞形态。荧光显微镜下清晰看到的绿色荧光，表明细胞与FITC(绿色)荧光标记的抗Ki67抗体结合，且与Hoechst33258染核的蓝色荧光完全重合，说明在人卵巢癌OVCAR3细胞中，CD105主要表达于细胞浆和细胞膜，Ki67则主要表达于细胞核。

Cy3-CD105

Hoechst

merged

FITC-Ki67

Hoechst

merged

注：A-1抗人抗体与OVCAR3胞浆上CD105结合，表现为胞浆内散在分布的红色荧光; A-2 仅用DAPI染细胞核;A-3用DAPI复染细胞核；B-1抗人抗体与OVCAR3细胞核内的Ki67结合，表现为胞核内散在分布的绿色荧光; B-2 仅用DAPI染细胞核;B-3用DAPI复染细胞核。

图2 CD105、Ki67蛋白在人卵巢癌OVCAR3细胞的表达及分布情况(放大倍数：400)

Fig.2 Expression and distribution of CD105 and Ki67 in human ovarian cancer OVCAR3 cells (×400)

3讨论

3.1 对CD105的研究现状

CD105(endoglin)，分子量180kDa，是由二硫键连接的同型二聚体跨膜糖蛋白，更多分布在增殖的内皮细胞。在恶性肿瘤包括卵巢癌，白血病，胃肠道间质瘤，黑色素瘤，和喉癌等肿瘤的血管内皮高表达，但很少表达于非内皮细胞[4-5]。目前国内外主要集中在研究肿瘤中CD105作为血管形成分子的角色和它作为肿瘤中微血管密度标记的作用[6]。

3.2对Ki67的研究现状

细胞增殖是肿瘤发生发展的一个重要的因素。Ki67抗原除G0期(细胞休眠期)，可表达在所有细胞周期阶段[7-8]。Ki67蛋白表达对肿瘤预后的影响及同肿瘤临床病理特征的关系提示在多种不同种类的癌症中起到重要作用[9]。因此Ki67是一个细胞增殖较为可靠的标志。以往的研究显示Ki67增生指数同一些癌症不良的远期无病存活和总体存活相关[10-12]。国外有研究表明，在卵巢恶性肿瘤中，细胞核内Ki67的表达>30%，预示Ki67在进展期卵巢癌中呈高表达[13]。

3.3对CD105、Ki67在体外培养人卵巢癌细胞系中的表达及部位研究

从上述实验结果可以看出，以β-actin为内参，所选取的6种体外培养的人卵巢癌细胞系中，在OVCAR3细胞中CD105、Ki67蛋白均呈高表达。据文献报道：CD105和Ki67共同强表达于肿瘤增殖活跃的内皮细胞，在表达肿瘤细胞增殖状态方面具有统一性[13]。目前CD105及Ki67已经被用于多种肿瘤的增殖程度的检测，临床上联合检测CD105及Ki67可能对于判断卵巢癌的恶性程度及预后有很大的帮助。

本实验中，采用体外培养人卵巢癌细胞，检测CD105及Ki67的表达。发现在OVCAR3细胞中二者均呈高表达；并且在OVCAR3细胞中CD105主要表达于细胞浆和细胞膜，Ki67则主要表达于细胞核。与既往在卵巢上皮癌组织病理切片中检测的CD105及Ki67的表达部位相符[14]。为下一步实验提取CD105及Ki67蛋白奠定实验基础。

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[专业责任编辑：安瑞芳]

Expression and location of CD105 and ki67 in human ovarian cancer cell lines

GUO Hai-rong1, LI Zeng-shan2, HE Shuai3, WANG Xiao-yan1, LIU Ping1

(1.The Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Baotou 014010, China; 2. Department of Pathology,The Fourth Military Medical University，Shaanxi Xi’an 710032；3. Department of Pathology,School of Basic Medical and Forensic Science, Baotou Medical College, Inner Mongolia Baotou 014060, China)

Objective To investigate the expressions of CD105 and ki67 in human ovarian cancer OVCAR3 cell lines and their location. Methods Cell lines with high expressions of CD105 and Ki67 were screened with Western blot from six human ovarian cancer cell lines. Immunofluorescene labelling assay was employed to investigate the location of CD105 and ki67 protein in OVCAR3 ovarian cancer cell lines. Results CD105 and Ki67 were both highly expressed in OVCAR3 cells lines. CD105 was mainly expressed in the cytoplasm and cell membrane, while Ki67 was mainly expressed in the nucleus. Conclusion CD105 and ki67 are highly expressed in human ovarian cancer OVCAR3 cell lines. CD105 is located in the cytoplasm and cell membrane, while Ki67 is located in the nucleus, which lay the foundation for the mechanism study of CD105 and ki67 in the development of human ovarian cancer.

CD105; ki67; OVCAR3; Western blot; immunofluorescence

2015-07-01

内蒙古自治区自然科学基金资助项目(2012MS1134)

郭海荣(1971-)，女，主任医师/硕士生导师，主要从事妇科肿瘤的研究。

刘 萍，教授/主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.09.038

R737.3

A

1673-5293(2016)09-1139-03