男性年龄对精子质量与精子染色体影响的研究*

孙宝刚 王丽霞 曹井贺 张 宁 粱鲁南 杨爱军

济宁医学院附属医院（山东济宁 272000）

男性年龄对精子质量与精子染色体影响的研究*

孙宝刚 王丽霞 曹井贺 张 宁 粱鲁南 杨爱军

济宁医学院附属医院（山东济宁 272000）

目的 探讨男性年龄对精子质量与精子染色体的影响。方法 选择男性精液标本120例，按照男方年龄分为3组：＜35岁组（n=42）、35岁～组（n=40）和≥40岁组（n=38）。对其进行精液分析以及精子DNA损伤检测，并应用18， X，Y号染色体探针通过荧光原位杂交（FISH）技术对＜35岁组、35岁～组和≥40岁组进行精子非整倍体检测。结果 3组精液量［（5.25±2.05）mL vs（5.05±2.26）mL vs（5.09±3.67）mL］、精子浓度［（28.21±3.08）×106/ mL vs（26.21±3.73）×106/mL vs（23.85±5.56）×106/mL ］和前向运动精子率［（30.05±9.34）% vs（28.30±8.04）% vs（26.30±5.08）%］差异均无统计学意义（P＞0.05）。＜35岁组与35岁～组的正常形态率［（7.20±2.30）% vs（6.56±3.20）%］和DNA碎片率［（14.69±3.69）% vs（16.12±4.52）%］以及精子非整倍体率［（2.71±0.56）% vs（3.45±0.65）%］相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。≥40岁组的正常形态率（4.68±2.89）%低于＜35岁组（7.20±2.30）%和35岁～组（6.56±3.20）%，差异有统计学意义（P＜0.05）；≥40岁组的DNA碎片率（24.86±7.85）%、精子非整倍体率（6.56±0.70）%均高于＜35岁组和35岁～组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 男性年龄增加可能导致精子正常形态率降低，精子DNA损伤率和精子非整倍体率增加，在生育过程中，男性年龄应引起关注。

年龄因素； 原位杂交， 荧光； 精子； 染色体； DNA损伤

据统计，近20%的夫妇患有不孕症，随着全面二胎的放开，更多高龄的夫妇加入生育的行列。母亲年龄对卵子染色体不利影响已是共识［1］，但是父亲年龄对精子质量、精子非整倍体率的重要性研究甚少。本文拟对男性年龄对精子质量与精子染色体影响的研究进行报道。

资料和方法

一、研究对象

对象选择2015年1月至2016年2月在济宁医学院附属医院生殖中心就诊的男性患者120例，不同年龄男性患者均无烟酒嗜好、无遗传性疾病、无传染性疾病，无接触X射线及无氰化物 、苯类 、二氧化硫等有毒物接触史和接受放、化疗患者。按照男方年龄分为3组：＜35岁组（n=42）、35岁～组（n=40）和≥40岁组（n=38）。

二、研究方法

1. 计算机辅助精子分析（CASA）：采用计算机辅助精子分析仪（西班牙， SCA）检测精子密度、总数、各级运动精子百分率和数量等。

2. 精子形态学分析（Diff-Quik法）：检测精子形态正常率=畸形精子数/计数精子总数×100%

3. 精子DNA 碎片率：采用深圳市博锐德生物科技有限公司产品试剂盒检测精子DNA 碎片率。

4. 精子荧光原位杂交（FISH）：应用北京金菩嘉公司的X、Y与18号染色体采用精子荧光原位杂交（FISH）技术荧光显微镜观察。

三、统计学处理

应用SPSS 16. 0对以上数据进行分析。均值比较采用多个样本比较的Kruskal-Wallis秩和检验，相关分析采用Spearman相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、各年龄组患者精液质量比较

各年龄组患者的精液量、精子浓度、前向运动（PR）精子率比较差异无统计学意义。＜35岁组与35岁～组的正常形态率［（7.20±2.30）% vs（6.56±3.20）%］和DNA碎片率［（14.69±3.69）% vs（16.12±4.52）%］，两组相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。正常形态率≥40岁组低于＜35岁组和35岁～组，DNA碎片率≥40岁组高于＜35岁组和35岁～组，差异均有统计学意义（P＜0. 05），见表1。

表1　各年龄组患者精子质量比较

二、精子染色体非整倍体率分析结果

本研究3组共计精子22 622个，其中非整倍体精子944个（异常18， X， Y染色体之和）。＜35岁组的非整倍体率低于35岁～组，两组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；≥40岁组的精子非整倍体率高于＜35岁组和35岁～组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2　各年龄组患者精子非整倍体率分析结果比较

讨 论

随着生育年龄的推迟以及全面二胎政策的放开，逐渐有越来越多高龄夫妻步入孕育新生命的行列。近年来，男性年龄对生育和子代的影响越来越受到关注。相对于女性，男性生育力可维持的时间较长，但随着年龄的增加以及不良的生活习惯、工作环境，男性生育功能也会逐渐减退。为了研究男性年龄对精子质量以及精子功能的影响，我们对＜35岁组、35岁～组和≥40岁组进行精液常规染色体精子以及DNA碎片率检测。结果发现：3组精液量、精子浓度、前向运动精子率差异均无统计学意义，＜35岁组与35岁～组的正常形态率、DNA碎片率以及精子非整体率相比，差异无统计学意义。≥40岁组的正常形态率低于＜35岁组和35岁～组，差异有统计学意义；≥40岁组的DNA碎片率高于＜35岁组和35岁～组，差异也具统计学意义。这与Vagnini等［1］和孙静波等［2］研究相似。由此发现：随着男性年龄增大，精子畸形率、DNA 碎片率随之升高，增加了在精卵结合及胚胎发生当中染色体异常和基因缺陷的可能性，从而提高了胚胎停育、早产及出生缺陷发生的风险。

精子染色体非整倍体即精子染色体数目异常，大多数研究显示［3，4］，染色体的非整倍体率增加是导致不孕不育、自然流产率升高和分娩率下降的主要原因。近年来，荧光原位杂交技术迅速发展，可以直接检测精子以及胚胎间期核的染色体组成［5-8］，一次可以分析大量精子，而且精子荧光信号直观，结果的敏感性、特异性和准确性等强 ，非常适合于精子染色体异常的研究。因此，我们实验室已经采用18， X，Y探针应用三色FISH技术分析 ＜35岁组、35岁～组和≥40岁组的共计22 622个精子，可以明确区分非整倍体、二倍体、缺体或杂交失败。

Sloter等［9］报道随着男性年龄的增长，该男性子代患染色体缺陷的风险可能增加。dela Rochebrochard等［10］报道男性年龄可能与自然流产相关。另外越来越多的研究显示男性不育与精子的非整倍体率存在相关性［11］，其不仅导致自然流产、死产和胚胎早期丢失，也是新生儿遗传病的主要原因之一，然而男性年龄与精子非整倍体发生率的相关性研究，未见相似性的报道。基于以上的研究背景，因此本研究旨在通过应用18，X，Y荧光原位杂交（FISH）技术对不同年龄男性精子的非整倍体进行检测，本研究结果发现，随着年龄增加，精子非整倍体率增加，≥40 岁组精子非整倍体率明显高于 ＜35岁组和 35岁～组，差异具统计学意义（P＜0.05）；＜35岁组与35岁～组比较差异无统计学意义。本研究显示，年龄增加对精子染色体有负面影响，当男性年龄＞40 岁时，精子非整体率显著增加，增大了精子发生过程中染色体异常的风险，从而增加了子代出生缺陷以及早产的危险性。因此在男性不育诊疗过程中，对高龄男性进行精子染色体分析有其必要性，能充分评估其生育风险，这将有助于其选择更加合理的生育方式。

对高龄男性患者在辅助生殖技术之前进行精液常规、DNA损伤率以及精子非整倍体检测，可以预测辅助生殖特别是卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）的成功率［12］，对辅助生殖前积极改善个人的不良生活习惯（吸烟、药物、职业环境、长期化学物质接触者）以及行针对性的治疗［13］（如：微创手术、口服抗氧化药物等）以改善精子的质量和减少患者精子DNA损伤以及精子非整倍体率，从而避免有缺陷的遗传物质传递给子代，而降低子代的出生缺陷的危险性。

综上所述，年龄与精子正常形态、精子DNA损伤以及精液非整倍体率有一定相关性，对于不育症患者，应考虑年龄因素。高龄对生育能力及后代生长发育的影响是个不容忽视的问题。在做辅助生殖治疗时，人们也必须关注男性的年龄，考虑男方年龄因素可能会影响辅助生殖助孕结果。这也将为男方诊断提供新的思路，为对育龄夫妇正确的生育指导提供理论依据，选择最佳的生育年龄，优生优育。

1 Vagnini L，Baruffi 1tLlt， MauTi AL， et al. The effects of male age on sperm DNA damage in an infertile population. Reprod Biomed Online 2007； 15（5）： 514-519

2 孙静波， 姜宏， 何瑞冰， 等. 精子DNA完整性与精液参数的相关性研究. 中国男科学杂志 2010； 24（4）： 26-29

3 Lewis-Jonc I， Aziz N， Seshadri S， et al. Sperm chromosomal ahnormalities are linked to sperm morphologic deformities. Fertil Steril 2003； 79（1）：212-215

4 Moosani N， Pattinson HA， Carter MD， et al. Chromosomal analysis of sperm from men with idiopathic infertility using sperm karyotyping and fluorescence in situ hybridization. Fertil Steril 1995； 64（4）： 811-817

5 Mercier S， Morel F， Fellman F， et al. Molecular analysis of the chromosomal equipment in spermatozoa of a 46，XY， t（7； 8） （q11. 21） carrier by using fl uorescence in situ hybridization. Hum Genet 1998； 102（4）： 446-451

6 李刚， 孙莹璞， 金海霞， 等. 胚胎植入前遗传学诊断10个周期的临床分析. 生殖与避孕 2007； 27（11）： 718-722

7 龙见桥， 庄广伦， 龙晓林， 等. 卵裂胚发育与染色体异常的关系. 南方医科大学学报 2008； 28（7）： 1276-1278

8 万均辉， 钟泽艳， 田佩玲. FISH技术在诊断唐氏综合征及植入前遗传学诊断中的临床应用. 中国计划生育学杂志 2011； 19（9）： 556-559

9 Sloter ED， Marchetti F， Eskenazi B， et al. Frequency of human sperm carrying structural aberrations of chromosome 1 increases with advancing age. Fertil Steril 2007； 87（5）： 1077-1086

10 de la Rochebrochard E， Thonneau P. Paternal age and maternal age are risk factors for miscarriage； results of a multicentre European study. Hum Reprod 2002； 17（6）：1649-1656

11 Sarrate Z， Vidal F， Blanco J. Role of sperm fl uorescent in situ hybridization studies in infertile patients： indications， study approach， and clinical relevance. Fertil Steril 2010；93（6）： 1892-1902

12 Bungum M， Humaidan P， Spano M， et a1.The predictive value of sperm chromatin structure assay （SCSA）parameters for the outcome of intrauterine insemination，IVF and ICSI. Hum Reprod 2004； 19（6）：1401-1408

13 Greco E， Iacobelli M， Rienzi L， et a1. Reduction of the incidence of sperm DNA fragmentation by oral antioxidant treatment. J Androl 2005； 26（3）： 349-353

（2016-05-30收稿）

Effects of males' age on sperm quality and aneuploidy of human sperms*

Sun Baogang， Wang Lixia， Cao Jingheng， Zhang Ning， Liang Lunan， Yang Aijun
Affi liated Hospital of Jining Medical College， Jining 272000， Shangdong， China

Objectivee To explore the effects of males'age on sperm quality and aneuploidy of human sperms. Metthhooddss Total of 120 semen samples were collected and divided into three groups according to the males'age， including＜35 yr group（n=42）， 35～ y group（n=40）， and ≥40 y group（n=38）. Based on the WHO Laboratory Manual （5th ed）， seminal parameters and aneuploidy of human sperms were detected and analyzed by tripl-color fl uorescence among the three groups. Results There were no statistically significant dilferences among the three groups in semen volume［ （5.25±2.05）mL vs（5.05±2.26） mL vs （5.09±3.67） mL］， sperm concentration［ （28.21±3.08） ×106/mL vs （26.21±3.73） ×106/mL vs （23.85±5.56）×106/mL］ and sperm motility［ （30.05±9.34） % vs （28.30±8.04） % vs （26.30±5.08） %］. There were no statistically signifi cant differences between ＜35 yr group and 35～39 yr group in sperm morphology［ （7.20±2.30） % vs （6.56±3.20） %］， sperm apoptosis［ （14.69±3.69） % vs （16.12±4.52） %］ and aneuploidy ［ （2.71±0.56） % vs（3.45±0.65）%］of human sperms. However， sperm morphology （4.68±2.89）%， sperm apoptosis（24.86±7.85）% and aneuploidy （6.56±0.70） % in ≥40 yr group on showed obvious differences compared with those in the group of ＜35yr and 35～yr. （P＜0.05）. Concluussiioonn Males'age increase might injure sperm normal morphology and sperm DNA integrity，result in an increase of sperm aneuploid.

age factors； in situ hybridization， fl uorescence； spermatozoa； chromosomes； DNA damage

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.07.008

R 698.2

资助： 山东省医药卫生科技发展项目（2015WS0410）；济宁市科技发展项目［济科字（2015）57号-15］；济宁医学院附属医院苗圃科研项目［JYFY-MP-2013-（ZD）-005］