结直肠癌组织和静脉血中KRAS基因突变分析及临床意义

伍洁

[摘要] 目的 研究结直肠癌组织与静脉血中KRAS基因突变情况，探讨其对临床治疗及预后的意义。 方法 整群收集2013年1月—2014年12月经病理科诊断手术的129例原发结直肠癌组织标本和肘静脉血5 mL及60例癌旁正常组织对照。用PCR-DNA直接测序法检测KRAS突变情况。 结果 ①癌组织KRAS突变率为39.53%（51/129），静脉血KRAS突变率为32.56 %（42/129）。静脉血KRAS基因突变率比癌组织的低6.97%，差异有统计学意义（P<0.05）。癌旁正常组织无基因突变。②KRAS基因有7种突变类型， 12密码子为主要突变占78.43%（40/51）。③癌组织与静脉血野生型与突变型整体的一致率为89.92%（116/129），一致性较高（K=0.783）。 结论 结直肠癌组织KRAS基因突变与静脉血高度一致，在肿瘤组织无法获取的情况下能代替其作为检测靶点。

[关键词] 结直肠癌；KRAS基因；突变；静脉血

[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2016）02（a）-0051-03

Analysis and Clinical Significance of KRAS Mutations in the Colorectal Carcinoma and Venous Blood

WU Jie

Mudanjiang Second People's Hospital，157000 China

[Abstract] Objective To research the KRAS mutations in the colorectal carcinoma and venous blood and discuss the significance of it to the clinical treatment and prognosis. Methods 129 cases of primary colorectal carcinoma specimen receiving the diagnostic operation in the department of pathology from January 2013 to December 2014 and 5ml elbow vein blood were collected and 60 cases of adjacent normal tissues were collected as controls， KRAS mutations were detected by PCR-DNA direct sequencing method. Results 1.The KRAS mutation rate was 39.53%（51/129） in the cancer tissues and 32.56 %（42/129） in the venous blood， the KRAS mutation rate in the venous blood was 6.97% lower than that in the cancer tissues， the difference was statistically significant （P<0.05）， and there was no mutation in adjacent normal tissues. 2.there were 7 types of mutations in the KRAS gene， 12 codons were the main mutation， accounting for 78.43%（40/51）. 3.the concordance rate between cancer tissues and venous blood of wild type and mutant type was 89.92%（116/129）， and it was higher （K=0.783）. Conclusion The KRAS mutation in the colorectal carcinoma is highly consistent with that in the venous blood， and it can be used as the detection target instead in the case of the tumor tissues unavailable.

[Key words] Colorectal cancer； KRAS gene； Mutation； Venous blood

结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，它的发生发展是一个复杂多基因信号通路激活的过程，它的恶性进展机制尚未完全清楚。EGFR基因在60%～75%的结肠癌患者中高表达，随着抗EGFR靶向药物临床广泛应用，有效降低患者死亡率同时也提高生存质量。原癌基因KRAS是下游重要细胞内信号转导因子，相关临床试验证实KRAS突变型的患者不能从抗治疗中获益，KRAS基因状态可决定患者治疗方案、临床耐药及预后[1]。基因检测是个体化治疗的基础，由于肿瘤组织的获取是有创性操作，对不能耐受手术无法活检的患者来说，意味无法准确施制个体化治疗方案。随着药物治疗原发灶和转移灶基因状态也可能会发生改变，临床治疗需要既方便获取又能够实时反映机体状态的靶标[2]。该研究分析该院2013年1月—2014年12月129例结肠癌患者癌组织和静脉血的KRAS基因突变情况，探讨静脉血替代癌组织进行基因检测的可行性及其对临床治疗和预后的意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

整群收集该院129例原发结肠癌经病理诊断手术切除的石蜡标本及60例癌旁正常组织对照，取患者术前空腹肘静脉血5 mL，离心后取上层血浆，-80 ℃冰箱保存备用。男性72例，女性57例；年龄21～76岁，平均（48.9±10.1）岁。入选患者术前均未行任何治疗。

1.2 实验方法

1.2.1 血浆DNA提取 DNA抽提试剂盒（纯化柱式）购自碧云天生物技术研究所。复温后向Ep管中加入PBS缓冲溶液涡旋摇散沉淀至絮状，加蛋白酶K、裂解液B涡旋混匀，置于70 ℃恒温箱中10 min后加无水乙醇混匀转入DNA纯化柱中置于废液收集管上离心。向纯化柱内先后加入洗涤液Ⅰ、Ⅱ及空离一次水浴后。将DNA纯化柱转入标记好的Ep管中放入-20 ℃冰箱保存待用。

1.2.2 组织DNA提取 采用碧云天生物技术公司的DNA提取试剂盒。对组织标本切8 μm厚10张，切取4 μm厚1张HE染色镜下观察肿瘤细胞集中区域，将切片对应归入EP管中脱蜡醇化，加入裂解液55 ℃水浴过夜，蛋白酶K消化，沉淀洗盐，-20 ℃冰箱保存备用，取样本行纯度测定稀释后行PCR检测。

1.2.3 PCR扩增纯化 由上海碧云天生物技术有限公司利用软件Premier 5.0设计PCR引物序列如下：KRAS基因第2号外显子：上游引物5-GTCGATATAGTTTGTAAATGAAGT-3下游引物5-CAGCTAAATTAAACATTTACTTC-3扩增片段长度为178 bp。PCR反应体系50 μL，反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min；降至4℃结束反应。于美国BIO-RAD580BR PCR仪器上进行基因扩增。用纯化试剂盒将PCR产物纯化。取5 μL PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳经溴化乙啶染色，紫外灯下照相存盘。紫外凝胶分析成像系统观察电泳结果并打印。

1.2.4 DNA分子直接测序 将检测有单一条带的样本送上海生物公司采用PCR-DNA直接测序法测序，经人工校对记录后用DNAMAN6.0软件与基因库BRAF基因序列比较结果。

1.3 统计方法

应用SPSS 17.0软件对数据进行分析，计数资料采用（n，%）表示，采用χ2检验，应用Kapparel方法统计一致性。

2 结果

2.1 KRAS基因突变情况

癌组织中KRAS基因突变率为39.53%（51/129）。静脉血中突变率为32.56 %（42/129）。癌组织较静脉血的突变率高9例6.97%，两者差异有统计学意义（χ2=4.92，P=0.027，P<0.05） 。60例癌旁正常肠组织无一例突变。

2.2 KRAS基因突变类型

突变类型有7种，主要为2号外显子突变。G12D、G13D常见。12密码子为主要突变占78.94%（40/51），其中G12D突变18例占35.29%最高。见表1。

表1 结直肠癌KRAS基因2号外显子突变类型

2.3 癌组织与静脉血基因检测结果比较

癌组织与静脉血的突变检测结果同时存在突变的有40例，以癌组织中检测的KRAS状态为准一致率78.43%（40/51），野生与突变整体的一致率为89.92%（116/129），一致性较高（Kappa=0.783）。见表2。

表2 癌组织与血浆KRAS基因突变分析

3 讨论

KRAS突变为肿瘤特异性的体细胞遗传改变，在正常细胞中无KRAS突变，肿瘤细胞的标志物也可能随着有效治疗发生改变，同时疾病进展肿瘤细胞的分化增殖是个动态的过程[3]。目前研究发现，肿瘤在发展过程中细胞从原发灶或转移灶脱落进入外周血，然后瘤细胞发生凋亡坏死并释放出遗传物质，导致血中存在游离肿瘤DNA，我们即可从血液中检测出基因突变[4]。

该研究发现KRAS基因突变为39.53%（51/129）。结果与文献[5-7]报道的30%～50%数据相符。外周血和肿瘤组织检测KRAS基因突变一致性达88.37%（114/129），马文华等人[6]检测48例CRC患者癌组织和血液KRAS基因突变一致率达73.7%，王建新等人[7]检测42例CRC患者癌组织和血浆KRAS基因突变一致率高达95.2%，为静脉血代替肿瘤组织检测KRAS突变提供了依据。有数据显示[5-8]KRAS基因突变率随着患者临床分期增高，KRAS基因突变率亦显著升高，提示有突变的患者更容易病情进展发生转移预后不良。密切观察患者病情进展情况，随访同时加强监测KRAS基因状态，为评价KRAS在预测转移及肿瘤进展的作用提供线索，并能基于血液检测基因突变情况开展靶向治疗研究，为有效干预结直肠癌的发病，降低患者死亡率提供理论依据。这也是我们今后研究的重要内容。

综上所述， 结直肠癌患者KRAS基因状态可以预测靶向药物疗效及预后，指导制定治疗方案，提高靶向治疗效果。结合文献该研究认为静脉血KRAS突变和癌组织突变检测率高度一致，标本容易获取，创伤较小适合临床治疗需求，患者在无法获取病理组织标本或样本量不足时能代替肿瘤组织实时监测KRAS基因突变情况，临床规范检测方法以提高结肠癌的早期诊断率及指导临床治疗，以实现患者的个体化治疗。

[参考文献]

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（收稿日期：2015-11-03）