代谢组学在奶牛蹄叶炎研究中的应用前景

李亚娟，董书伟，王东升，张世栋，严作廷，杨志强，杜玉兰，何宝祥

（1.广西大学动物科技学院，南宁530005；2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，兰州730050）

综述与专论

代谢组学在奶牛蹄叶炎研究中的应用前景

李亚娟1，2，董书伟2，王东升2，张世栋2，严作廷2，杨志强2，杜玉兰1，何宝祥1

（1.广西大学动物科技学院，南宁530005；2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，兰州730050）

代谢组学是研究生物体在内外源因素影响下，其内源性代谢物种类、数量变化规律的一门新兴学科，在兽医科研中应用也日益广泛。蹄叶炎是影响奶牛养殖业发展的重要疾病之一，但其发病机理目前尚无定论，文章对代谢组学和奶牛蹄叶炎的研究现状及其在奶牛蹄叶炎研究中的应用前景进行了探讨。

代谢组学；奶牛；蹄叶炎

随着奶牛养殖业的规模化和集约化发展，一些对奶牛危害严重的传染病已得到了有效控制，乳房炎、蹄病和繁殖系统疾病成为引起奶牛被迫过早淘汰的三大疾病［1］。近年来，我国每年因奶牛蹄病而过早淘汰的牛数占淘汰牛总数的15%～30%，造成高达2 250万元的经济损失［1］；2007年赵月兰等［2］调查了河北省13个奶牛养殖场中的33 600头奶牛，蹄病总发病率为14.60%；何勇军等［3］报道了2005年广州市奶牛场因蹄病被淘汰牛只占淘汰牛数的31.8%。由此可见，蹄病对奶牛养殖业危害严重。其中蹄叶炎是奶牛最为常见的一种蹄病，41%的蹄病是蹄叶炎，72%的奶牛至少有一个蹄发生过此病［4］。蹄叶炎会引起蹄部疼痛、运动障碍或慢性蹄变形［5］，还会导致蹄底溃疡、白线病及蹄底出血等多种疾病，不但影响奶牛健康和动物福利，而且会降低饲料报酬。因此，有效防控奶牛蹄叶炎对奶业的健康发展有十分重要的经济意义和价值［6］。

代谢组学是系统生物学的重要组成部分，是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一门新兴学科。代谢组学主要通过发现内源性代谢物整体变化的轨迹来反映病理生理过程中所发生的一系列生物学事件，对整体代谢物进行系统分析有助于人们掌握代谢物在疾病发生发展过程中的变化规律，对了解疾病的发病机理，开展早期诊断和临床治疗研究具有重要价值［7］。奶牛蹄叶炎是全身代谢紊乱的局部表现［8］，因此，代谢组学将可能是研究奶牛蹄叶炎的得力工具，通过揭示发病过程中内源性代谢物的变化规律，从而揭示其发病机制，为早期诊断和临床治疗提供新的依据。本文对代谢组学和奶牛蹄叶炎的研究近况及代谢组学在奶牛蹄叶炎方面的应用前景作一探讨，为今后奶牛蹄叶炎的研究提供新的思路。

1 代谢组学的研究进展

1.1 代谢组学的概念及研究内容

代谢组是1998年由Tweeddale等在研究大肠杆菌的代谢时首次提出的，其简略定义为“代谢物整体”，并且指出代谢物组成分析能够提供有关细胞代谢和调控的重要信息。代谢组学的概念由Nicholson等［9］于1999年首次提出，并将其定义为对生物系统因病理生理或基因改变等刺激所致动态多参数代谢应答的定量测定，并可用于动物生理、药物毒理、基因表型、疾病诊断和系统生物学为基础的功能基因组学等方面研究［10-11］。代谢组学主要研究在内外环境影响下生物体系（细胞、组织或器官或机体）所产生的所有代谢产物的变化。目前，代谢组学研究的主要层次有：①代谢组或代谢组学：代谢组指生物体对体系内、外因素做出动态应答的所有代谢物分子集合；代谢组学定义为对生命体系因环境刺激、病理生理扰动或基因改变等引起的体现为所有代谢物动态应答的系统性度量［12-13］。②代谢指纹分析：对样品进行整体的定性分析，比较图谱差异对样品进行快速鉴别和分类，而不分析或测量具体组分［14］；③代谢轮廓（谱）分析：采用精确的分析方法，对特定代谢过程中的结构或性质相关的代谢物进行定量或半定量测定［15］。④代谢物靶标分析：对生物样品中感兴趣的代谢物，选择特定的一个或多个进行定性或定量测定［7］；⑤代谢表型分析：在代谢组分析的基础上，对产生代谢物的有关生物和细胞进行分类和鉴定［16］。

1.2 代谢组学的主要研究技术及分析流程

代谢组学分析的原则是：根据代谢物物理化学参数的差异，采用不同的仪器分析方法，尽量满足高选择性、高灵敏度、高通量、多维、动态、多参数的特点，尽可能多地分离鉴定出不同性质的代谢物的种类和数量。当前代谢组学常用的技术包括气相色谱-质谱法（GC-MS）、高速液相色谱-质谱法（HPLC-MS和LC/MS/MS）、核磁共振波谱法（NMR）、傅里叶变换红外光谱法（FT-IR）［7］。其中GC-MS技术、NMR技术以及LC-MS技术的应用较为核心，GC-MS具有较高的分辨度和灵敏度以及良好的重现性，并且具有相对较为完整的鉴定数据库，但对物质的热稳定性和挥发性有一定要求［17-18］；NMR能够在最接近生理的条件下进行试验，实现对样品的无破坏性、无偏向的检测，具有良好的客观性和重现性，避免了繁琐的预处理，具有较高的通量和较低的单位样品检测成本，但是NMR平台的分辨率和灵敏度相对较低［19］；LC-MS技术有较高的灵敏度和较宽的动态范围，但目前尚无完整图谱的数据库可供参考，主要用于分析、分离和鉴定样品中微量的药物和代谢产物，弥补了GC-MS技术的不足［20］。

代谢组学分析流程通常包括生物样品分析和数据处理两大部分，生物样品分析的目的是产生原始数据，包括样品采集、样品预处理、运用分析技术进行代谢物整体性分析；数据处理的目的是揭示在内外因素影响下代谢的整体性差异，全面了解机体的生理病理过程，筛选生物标记物，主要包括原始数据的获得、数据预处理、统计学分析和生物信息学分析（详见图1）。

图1 代谢组学分析流程图

1.3 代谢组学的主要研究进展

代谢组学是基因组学、转录组学和蛋白质组学的延伸，代谢物是生物系统生化过程调控的最终分子产物，可直观而全面地反映生命活动的变化，因此，代谢组学成为研究生命体系功能变化的强有力手段［21］，被广泛应用于基础生命科学、疾病临床诊断、药物研发、营养科学、中医药研究等诸多领域。Raamsdonk等［22］利用FANCY（function analysisby co-responses in yeast）方法对野生型FY23及6种酵母突变体进行了研究，通过分析指数生长期的酵母代谢组，发现使用代谢组学的方法能对具有生物活性的相关基因进行分类，并且能正确区分性质相似但程度不同的表型突变。另外，通过比较健康和患病或疾病不同发展阶段的机体代谢谱差异，寻找与疾病相关的生物标记物，开发疾病的早期诊断技术，为了解发病机制和临床防治有重要作用。Fan等［23］通过使用13C作为示踪剂，结合NMR和GC-MS方法，比较非小细胞肺癌患者的肿瘤组织与周边非肿瘤组织，发现肿瘤组织中初级代谢产物水平更高，乳酸盐、丙氨酸等代谢物水平也有显著差异，提示肿瘤组织有更为活跃的糖酵解和三羧酸循环过程。Nakayama等［24］利用GC-MS方法研究了手术后胃癌和结肠癌患者用5-氟尿嘧啶治疗后尿中代谢物的变化，认为尿中嘧啶代谢产物可用来预测5-氟尿嘧啶对癌症患者的治疗反应。

在兽医学研究中，代谢组学的应用也有可喜的进展。如Mifumi等［25］使用代谢组学的方法研究了犬口腔黑色素瘤，发现代谢物轮廓分析可有效区分和诊断犬口腔黑色素瘤，并可用于放射治疗的预后评估。郭延生等［26］利用GC-MS技术发现，在奶牛热应激过程中葡萄糖、α-亚麻酸、甘油、亚油酸、棕榈酸、β-羟丁酸和甘氨胆酸盐含量显著降低，而乳酸含量显著升高，说明热应激促进了奶牛能量的负平衡，认为这8个内源性代谢物可作为奶牛热应激的生物标记物。TianH等［27］利于NMR和LC-MS相结合的方法分析了奶牛热应激的血浆代谢谱，发现葡萄糖和乳酸等13种差异代谢物作为热应激的潜在标志物具有很好的特异性和敏感性。李影等［28］运用基于NMR的代谢组学方法研究奶牛不同类型酮病的血浆代谢图谱，并结合多元统计分析方法（PCA和OPLS-DA），寻找潜在的生物标记物，结果发现，Ⅰ型酮病、Ⅱ型酮病与健康对照的代谢图谱差异明显，Ⅱ型酮病与健康对照组之间存在丙氨酸、赖氨酸、β-羟丁酸、丙酮和乳酸等7种血浆差异代谢物，认为代谢组学方法可有效区分酮病与健康奶牛之间血浆差异性代谢物，为进一步探究奶牛酮病的发病机理和诊断与防治提供了新的方向。

综上所述，代谢组学技术日趋成熟，已成为生物医学领域重要的研究手段，在疾病研究领域有广阔的应用前景，并且两种或多种的代谢物分析方法相结合能鉴定出更多的分子，使得代谢谱更接近于真实，这将是今后代谢组学研究的新方向。

2 奶牛蹄叶炎研究现状

2.1 奶牛蹄叶炎的概念及临床症状

奶牛蹄叶炎是蹄壁真皮乳头层和血管层发生的弥漫性、浆液性和无菌性炎症［6］，通常可侵害几个指（趾），呈现局部或全身性症候。根据病程，通常将奶牛蹄叶炎分为急性型和慢性型。急性蹄叶炎奶牛一般表现出较为明显的临床症状，体温升高至40～41℃，食欲不振，精神不佳，产奶量下降。病牛指（趾）几乎无外观变化，行走困难，步态轻柔，站立时弓背，四肢收于腋下，严重时两前肢交叉，指（趾）部疼痛明显。发病早期病牛常出汗，肌肉震颤。慢性型蹄叶炎病牛多由急性病例转变而来，一般无明显全身症状，重症患牛也会发生全身强直、跛行、弓背和前肢弯曲。病牛站立时蹄底负重不实，蹄球部负重，患指（趾）前缘弯曲，趾间弯曲，蹄轮向后下方延伸且彼此分离。蹄骨尖下移，其背侧缘与地面角度加大，导致蹄骨对蹄底真皮的压迫增加，形成角质缺损，使蹄底穿孔的危险增加，进而引起蹄叶炎。

2.2 奶牛蹄叶炎的发病原因

奶牛蹄叶炎的病因复杂，认为该病是由综合因素引起的，包括营养、管理、疾病、年龄与生长发育、遗传、季节、产犊等诸多因素［29］。随着对奶牛蹄叶炎研究的逐渐深入，目前普遍认为乳酸、内毒素和组胺是诱发该病的主要因素［8，30］。在集约化的规模养殖中，为提高产奶量，饲养管理者往往会加大精料的供给，然而，过多采食精料，瘤胃异常发酵，可引起乳酸和组胺的大量产生，瘤胃内微生物释放内毒素，这些因子会诱发蹄叶炎［31］。另外，环境卫生也是本病发生的重要因素，圈舍卫生条件差，粪便泥浆浸泡，异物刺激，以及长时间在坚硬或凹凸不平的地面上行走也会诱发本病［32］；本病还会继发于子宫内膜炎、酮病、乳房炎、胎衣不下等产后疾病［33］；初产母牛的蹄叶炎发病率较高,青年母牛和幼龄牛易患蹄叶炎。急性蹄叶炎常见于母牛第1次产犊时,青年母牛比成年母牛多见［29］。

2.3 奶牛蹄叶炎的发病机制

蹄叶炎的病因繁杂，发病机理目前也尚无定论。当前，国内外学者普遍认同：奶牛蹄叶炎发病是由于日粮中添加高能饲料太多，在瘤胃内过度发酵，引起乳酸升高，瘤胃内pH值降低，革兰氏阳性细菌大量繁殖，而大部分革兰氏阴性细菌崩解，释放出内毒素，随血液循环进入蹄部，作用于蹄底真皮毛细血管壁，引起蹄部的微循环障碍，继而发生弥漫性血管内凝血和蹄组织缺氧；当瘤胃内pH值降低到4.5以下时，多种细菌会将组氨酸脱羧，产生高浓度的组胺，随血液循环到达蹄部，作用于蹄真皮，引起毛细血管通透性增强，从而造成局部组织充血和血管损伤［34-35］，上述因素共同作用，最终引起奶牛发生蹄叶炎［36］。

Medina等［37］采用过度饲喂寡聚果糖的方法制造马蹄叶炎的病理模型，并使用代谢组学的方法对血浆和蹄部间质层组织间隙液进行分析，发现苹果酸、丙酮酸、乌头酸、羟乙酸是导致健康组和对照组血浆代谢轮廓差异的主要因素，而能量代谢障碍只是局部地发生在层状间质中，而在血浆中检测不出来。Medina的研究对于进一步认识奶牛蹄叶炎发病机理有重要启示，可能是某种有害物质干扰了肢蹄局部微循环，导致能量吸收障碍，而血液由于其自我稳态调控，并未表现出明显的能量代谢障碍。齐长明等［8］使用二磷酸组织胺皮下注射制造奶牛的蹄叶炎病理模型，蹄部位的真皮，尤其是蹄底和蹄球的真皮网状层内,血管内存在大量血栓,小动脉数量增多,管壁变得十分肥厚,管腔变窄,有的动脉壁发生分离,这种小动脉的硬化和损伤非常普遍。引起血管损伤的物质可能为组织胺和内毒素,内毒素可以直接作用于血管,引起病变,而组织胺可以通过变态反应,间接引起血管的损害，通过这些有害物质作用于蹄真皮引发蹄叶炎。

3 展望

在生物的生命活动中，任何病理或生理因素导致的机体生化功能的改变，最终均会引起代谢物比例或浓度的变化，从而在体液或组织中得到反映，因此，可以利用代谢组学的方法研究任一生命现象和过程。随着分析化学技术和方法的发展和质谱仪的不断更新换代，代谢组学的检测技术和数据库不断完善，分离和鉴定出的代谢物将会越来越多，将会更真实地反映机体内所有代谢物的变化，为寻找复杂疾病发生发展过程中的生物标记物和疾病的早期诊断与治疗提供新的思路，也为将代谢组学技术推向更多领域的应用奠定了坚实的技术基础。

尽管多年来国内外学者一直致力于研究奶牛蹄叶炎，但其病因和发病机理尚未明确定论。目前，对于奶牛蹄叶炎的研究往往关注某一单个因素，但在代谢层次上，系统而全面的研究尚未见报道，因此，奶牛发生蹄叶炎后：①其全身代谢发生了什么样的变化？②发病时有哪些代谢途径发生了改变？③主要有哪些代谢物发生了改变，在本病发生过程中起什么作用？这些问题还需要解答。代谢组学是组学时代的新兴学科，系统生物学的重要组成部分。运用代谢组学的方法研究奶牛蹄叶炎发病后机体代谢整体的变化，结合生物信息学分析，找出相关的代谢途径，为蹄叶炎的早期诊断与防治提供新的途径。此外，国内外尚未见关于奶牛蹄叶炎代谢组学的报道，应用代谢组学的方法研究该病，可丰富和发展对奶牛蹄叶炎病因学和发病机理的认识，进一步提高奶牛营养代谢病的理论水平。因此，运用代谢组学的理论与技术研究奶牛蹄叶炎具有重要的理论价值与现实意义。

［1］严作廷，王东升，王旭荣，等.我国奶牛主要疾病研究进展［J］.中国草食动物，2011，31（6）：69-72.

［2］赵月兰，秦建华，左玉柱，等.河北省奶牛肢蹄病发病情况调查及防治效果观察［J］.黑龙江畜牧兽医，2007（4）：69-71.

［3］何勇军，叶左局，邵碧雄.南亚热带区肢蹄病对荷斯坦奶牛在群寿命的影响［J］.安徽农业科学，2005，33（11）：517-6611.

［4］李福伟，张丽红，吴玄光.奶牛蹄叶炎的研究概况［J］.广东畜牧兽医科技，2005（2）：11-13.

［5］Miguel-Pacheco GG，Kaler J，Remnant J，et al.Behavioural changes in dairy cows with lameness in an automatic milking system［J］. Applied Animal Behaviour Science，2014，150：1-8.

［6］Boosman R，Né meth F，Gruys E.Bovine laminitis：Clinical aspects，pathology and pathogenesis with reference to acute equine laminitis［J］. Veterinary Quarterly，1991，13（3）：163-171.

［7］Dunn W B，Ellis D I.Metabolomics：Current analytical platforms and methodologies［J］.TrAC Trends in Analytical Chemistry，2005，24（4）：285-294.

［8］齐长明，王清兰，钟友刚，等.二磷酸组织胺诱发奶牛蹄叶炎病变的病理学研究［J］.畜牧兽医学报，2000，31（3）：241-248.

［9］Nicholson JK，Lindon JC，Holmes E.'Metabonomics'：understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data［J］.Xenobiotica，1999，29（11）：1181-1189.

［10］Griffin J L，Williams H J，Sang E，et al.Metabolic profiling of genetic disorders：a multitissue（1）H nuclear magnetic resonance spectroscopic and pattern recognition study into dystrophic tissue［J］.Anal Biochem，2001，293（1）：16-21.

［11］Holmes E，Antti H.Chemometric contributions to the evolution of metabonomics：mathematical solutions to characterising and interpreting complex biological NMR spectra［J］.Analyst，2002，127 （12）：1549-1557.

［12］Nicholson J K，Wilson ID.Opinion：understanding'global'systems biology：metabonomics and the continuum of metabolism［J］.Nat Rev Drug Discov，2003，2（8）：668-676.

［13］Jc L，EH，Jk N.So what's the deal with metabonomics?［J］.Analytical Chemistry，2003,75（17）：384A-391A.

［14］Ellis D I，Goodacre R.Metabolic fingerprinting in disease diagnosis：biomedical applications of infrared and Raman spectroscopy［J］. Analyst，2006,131（8）：875-885.

［15］Fernie A R，Trethewey R N，Krotzky A J，et al.Metabolite profiling：from diagnostics to systems biology［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2004，5 （9）：763-769.

［16］Fiehn O.Metabolomics——the link between genotypes and phenotypes ［J］.Plant Mol Biol，2002,48（1-2）：155-171.

［17］Dunn W B，Broadhurst D,Ellis D I,et al.A GC-TOF-MS study of the stability of serum and urine metabolomes during the UK Biobank sample collection and preparation protocols［J］.Int J Epidemiol，2008，37（suppl1）：i23-i30.

［18］Kioussi M K，Lyris EM，Angelis Y S，et al.A generic screening methodology for horse doping control by LC-TOF-MS，GC-HRMS and GC-MS［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2013，941：69-80.

［19］Taylor J，King R D，Altmann T，et al.Application of metabolomics to plant genotype discrimination using statistics and machine learning［J］. Bioinformatics，2002，18（suppl2）：S241-S248.

［20］胡正青，林夏珍，郭明.代谢组学研究技术进展［J］.中国现代应用药学，2010（6）：485-490.

［21］Weckwerth W,Morgenthal K.Metabolomics：from pattern recognition to biological interpretation［J］.Drug Discov Today，2005,10（22）：1551-1558.

［22］Raamsdonk L M,Teusink B,Broadhurst D,et al.A functional genomics strategy that uses metabolome data to reveal the phenotype of silent mutations［J］.Nat Biotechnol，2001,19（1）：45-50.

［23］Fan T W，Lane A N，Higashi R M，et al.Altered regulation of metabolic pathways in human lung cancer discerned by（13）C stable isotoperesolved metabolomics（SIRM）［J］.Mol Cancer，2009，8：41.

［24］Nakayama Y，Matsumoto K，Inoue Y，et al.Correlation between the urinary dihydrouracil-uracil ratio and the 5-FU plasma concentration in patients treated with oral 5-FU analogs［J］.Anticancer Res，2006，26（5B）：3983-3988.

［25］Kawabe M，Baba Y，Tamai R，et al.Profiling of plasma metabolites in canine oral melanoma using gas chromatography-mass spectrometry ［J］.J Vet Med Sci，2015，77（8）：1025-1028.

［26］郭延生，贾启鹏，陶金忠.基于GC-MS策略的奶牛热应激血液代谢组学研究［J］.畜牧兽医学报，2015（8）：1356-1362.

［27］Tian H，Wang W，Zheng N，et al.Identification of diagnostic biomarkers and metabolic pathway shifts of heat-stressed lactating dairy cows ［J］.J Proteomics，2015，125：17-28.

［28］李影，徐闯，夏成，等.基于1 HNMR技术的奶牛I型和II型酮病血浆代谢谱分析［J］.中国农业科学，2015（12）：2449-2459.

［29］韩开顺，孙汉昌，陈洪飞.奶牛蹄叶炎的临床特征及病因分析［J］.养殖与饲料，2007（6）：40-43.

［30］Kleen J L，Hooijer G A，Rehage J，et al.Subacute ruminal acidosis （SARA）：a review［J］.J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med，2003，50 （8）：406-414.

［31］Enemark J M.The monitoring，prevention and treatment of subacute ruminal acidosis（SARA）：a review［J］.Vet J，2008，176（1）：32-43.

［32］Bergsten C.Causes，risk factors,and prevention of laminitis and related claw lesions［J］.Acta Vet Scand Suppl，2003，98：157-166.

［33］Nordlund K V，Cook N B，Oetzel GR.Investigation strategies forlaminitis problem herds［J］.Journal of Dairy Science，2004，87（Suppl）：E27-E35.

［34］Black S J.Extracellular matrix，leukocyte migration and laminitis［J］. Vet Immunol Immunopathol，2009，129（3-4）：161-163.

［35］Westwood CT，Bramley E，Lean IJ.Review of the relationship between nutrition and lameness in pasture-fed dairy cattle［J］.N Z Vet J，2003，51（5）：208-218.

［36］Stone W C.Nutritional approaches to minimize subacute ruminal cidosis and laminitis in dairy cattle［J］.J Dairy Sci，2004，87 （Electronic Supplement）：E13-E26.

［37］Medina-Torres C E，van Eps AW，Nielsen L K，et al.A liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based investigation of the lamellar interstitial metabolome in healthy horses and during experimental laminitis induction［J］.The Veterinary Journal，2015，206 （2）：161-169.

Metabonomics and Its Application Prospect in Laminitis of Dairy Cow

Li Yajuan1，2，Dong Shuwei2，He Baoxiang1，et al
（1.College of Animal Science and Technology，Guangxi University，Nanning530005，China；2.Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of CAAS；Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutical Development，Ministry of Agriculture；Key Laboratory of New Animal Drug Project，Gansu Province，Lanzhou 730050，China）

Metabonomics is a new science and technology in recent years which refers to research the species and amounts change of endogenous metabolites when the organism was affected by the alteration of genes or environment.And metabonomics was applied widely in veterinary.Laminitis is one of the serious diseases which can restrict the development of dairy industry，however，the etiology of laminitis remains unclear.This paper reviewed the main progress in metabonomics and laminitis in dairy cow，and the prospect of metabonomics application in research on laminitis in dairy cow.

laminitis；dairy cow；metabonomics

S823.7

A

2095-3887（2016）04-0049-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.04.014

2016-04-22

国家自然科学青年基金项目（31302156）；甘肃省青年科技基金计划（1506RJYA145）；中央级基本科研业务费项目（1610322014012）

李亚娟（1992-），女，硕士研究生。

董书伟（1980-），男，助理研究员，博士，主要从事奶牛疾病研究；何宝祥（1958-），教授，博士生导师，主要从事牛代谢疾病与分子生物学研究工作。