羔羊腹泻病原菌常规分离鉴定及药敏试验

汤继顺，惠文巧，朱德建，陈 胜，苏世广

（安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，合肥 230031）

疾病防制

羔羊腹泻病原菌常规分离鉴定及药敏试验

汤继顺，惠文巧，朱德建，陈 胜，苏世广

（安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，合肥 230031）

从安微省合肥、滁州地区的肉羊养殖场中共采集到羔羊腹泻粪样11份，进行细菌分离培养与镜检，将分离的细菌进行纯培养，并进行生化鉴定、药敏试验和小鼠攻毒致病性检验。结果显示：在检测的11份粪样中，共检测出大肠杆菌11株、奇异变形杆菌7株；致病性试验显示大肠杆菌和奇异变形杆菌均对小鼠有致病力，但奇异变形杆菌致病性弱于大肠杆菌；药敏试验显示分离菌株对恩诺沙星、氟苯尼考、卡那霉素、丁胺卡那霉素、菌必治、复方新诺明、丙氟哌酸、头孢唑啉等敏感，对庆大霉素、氟哌酸等常规药物均表现出一定的耐药性，对青霉素、链霉素、克拉霉素、红霉素和强力霉素等完全耐药。结果表明，大肠杆菌和奇异变形杆菌都有一定的致病性，上述地区羔羊腹泻是由混合感染引起，且混合感染致病性更强。

羔羊腹泻；大肠杆菌；奇异变形杆菌；分离鉴定；药敏试验

在动物临床诊断技术日益发展的今天，越来越多的先进实验诊断方法不断涌现，为疾病确诊提供了更多的选择，但常规的实验操作和诊断方法不需要较高的实验操作技能和昂贵的设备，仍存在一定应用价值，可供临床诊断选择。在疾病初发期，如羔羊腹泻，往往可以采用此种诊断技术来进行病原菌确诊，进而快速筛选敏感药物。羔羊腹泻是指吮乳羔羊所发生的腹泻，是严重影响羔羊成活和生长的主要疾病之一［1］，其病因复杂，除了日常饲养管理外，疾病因素不容忽视，目前国内外关于羔羊腹泻的研究很多，治疗药物也多种多样。在走访安徽省部分地区时发现，每个肉羊场都会出现羔羊腹泻现象，依据饲养场的环境状况，发病率有所不同，羔羊甚至出现反复发病，生长停滞，给养殖造成不小的经济损失。笔者等根据腹泻羔羊表现的临床症状，采集腹泻粪样，分离病原，采用常规实验诊断方法进行生化鉴定和药敏试验，并依据试验结果提出治疗方案，以期为羔羊腹泻病的病原检测和防治提供方法和依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

分别在安徽合肥、滁州两个地区几个规模化养羊场，选取腹泻且未经治疗的羔羊，用无菌棉球棒直肠取粪样，置于灭菌的2mL试管中保存。共采集羔羊腹泻粪样11份，其中合肥地区羊场5份，滁州地区羊场6份。

1.2 试验试剂与接种动物

试验试剂：麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、血琼脂、SS琼脂、三糖铁琼脂、普通营养琼脂和营养肉汤培养基，生化鉴定管与药敏片（恩诺沙星、氟苯尼考、氨苄青霉素、氟哌酸、卡那霉素、青霉素、链霉素、丁胺卡那、多粘菌素B、庆大霉素、痢特灵、菌必治、复方新诺明、丙氟哌酸、头孢唑啉、新霉素、克拉霉素、阿奇霉素、红霉素、强力霉素共20种）购自杭州微生物试剂有限公司。

接种动物：70只健康雄性昆明系小鼠，体重20 g左右，购自安徽医科大学实验动物房。

1.3 试验方法

1.3.1 病原菌的分离培养 将采集的粪样按常规方法接种于麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、血琼脂培养基和SS琼脂培养基上，37℃恒温培养24 h，观察细菌在各种琼脂平板上的生长情况。用无菌接种环分别挑取麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上的单个菌落，接种普通营养琼脂斜面，37℃纯培养24 h，将纯培养物接种营养肉汤和三糖铁琼脂。

1.3.2 形态学鉴定 对纯培养物涂片，革兰氏染色，固定，镜检。

1.3.3 生化鉴定 挑取纯培养物接种于三糖铁琼脂、糖微量发酵管（葡萄糖、木糖、棉子糖）、半固体琼脂、氨基酸生化管（赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸）、尿素分解管、硫化氢、蛋白胨水、山梨醇、侧金盏花醇、枸椽酸盐管，并进行甲基红（MR）试验、VP试验等，37℃培养24～72 h，观察并记录结果。

1.3.4 致病性检测 根据细菌培养结果，挑取纯培养的菌落，接种于营养肉汤中，37℃恒温培养24 h，营养肉汤均匀浑浊，取营养肉汤菌液培养基，备用。取健康小鼠，根据不同地区和分离细菌种类分组，并设对照组，每组10只。将上述制备的待测菌液腹腔接种于试验组小鼠（0.3mL/只），对照组小鼠注射等量营养肉汤，观察48 h，记录症状。如有死亡，剖检死亡小鼠，无菌采集心脏血、肝脏和脾脏，涂片、革兰氏染色、镜检。同时蘸取少量腹水在麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上均匀涂抹，37℃培养18～24 h后，观察结果。

1.3.5 药敏试验 将纯培养的细菌菌液滴入普通营养琼脂平皿上，用涂抹器涂抹均匀或接种环划线，用无菌镊子将20种药敏纸片分别贴于培养基表面，每块平皿上贴4～5片，各片之间距离相等，37℃培养24 h观察结果。根据药物纸片有无抑菌圈及其大小来判断待测菌对各种药物的敏感程度，判断标准参照中华人民共和国卫生行业标准——纸片法抗菌药物敏感试验标准［2］。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 病原菌培养特性及形态特征

由表1可知，在采集的11份羔羊腹泻粪样中，可得到两种不同形态特征菌落，记为C菌与M菌，其中C菌共培养11株（合肥地区记为HC菌，共5株；滁州地区记为CC菌，共6株），M菌共培养7株（合肥地区记为HM菌，共3株；滁州地区记为CM菌，共4株）。C菌和M菌在这几种琼脂培养基中均能生长，但菌落颜色、生长方式不尽相同，C菌在血琼脂培养基中有β溶血现象，M菌在营养琼脂中有腐臭味。

表1 分离菌的培养特性及形态特征

2.2镜检结果

将C菌和M菌中每个菌落纯培养物涂片后，革兰氏染色为阴性，在显微镜下观察，C菌为短杆菌，两端钝圆，大多单个存在，有的成对存在，不形成芽孢和荚膜；M菌两端钝圆，形态多样，有杆状、球状等，无荚膜，不形成芽孢。根据羔羊腹泻粪便中分离得到的细菌的培养特性和形态特征，可初步判定其为肠道杆菌。

2.3 分离菌生化鉴定结果

分离菌生化特性试验结果见表2。C菌能分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、产酸又产气。葡磷胨水（VP-MR）试验阴性，产生靛基质（吲哚），不分解尿素酶，不产生硫化氢，有运动力，不能利用枸椽酸盐。M菌发酵葡萄糖，产酸产气，不发酵乳糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇；尿素酶、硫化氢试验阳性；靛基质阴性；有运动力。从分离菌的生化特性，结合培养特性和形态特征，判定C菌为大肠埃希菌，M菌为奇异变形杆菌。

表2 分离菌株的生化特性

2.4 致病性试验结果

由表3可见，菌液注射后8 h，试验组小鼠开始出现精神萎靡，食欲、饮水下降，打堆，活动减少，大部分小白鼠尿色变深，尾根部出现稀粪附着；24 h后出现死亡和腹泻，发病小鼠蜷缩不动；36 h后，死亡率下降；48 h后，基本没有死亡。混合菌感染组小鼠发病率达100%，死亡率高达90%以上。剖检死亡小鼠，发现所有死亡小鼠的腹腔内均有浆液渗出，脾脏坏死，肝脏边缘坏死，大肠臌气，暗红，肠道充满黄色液体。从死亡小鼠的肝脏、心脏及肠液中回收细菌，经染色镜检并进行细菌培养和生化试验，结果与接种菌一致。对照组小鼠全部成活。

表3 分离菌的致病性检验

2.5 药敏试验结果

由表4可见，对大肠杆菌（C菌）敏感的药物有恩诺沙星、氟苯尼考、卡那霉素、丁胺卡那霉素、痢特灵、菌必治、复方新诺明、丙氟哌酸、头孢唑啉和阿奇霉素；对奇异变形杆菌（M菌）敏感的药物有恩诺沙星、氟苯尼考、卡那霉素、丁胺卡那霉素、菌必治、复方新诺明、丙氟哌酸、头孢唑啉；两种菌对氟哌酸、庆大霉素和新霉素等药物均为中等敏感，对青霉素、链霉素、克拉霉素、红霉素和强力霉素等完全耐药。

表4 药敏试验结果

3 讨 论

3.1 羊场调研情况

在羊场实际调研中发现，羔羊腹泻造成较高的死亡率，这是因为很多羊场饲养环境差，粪污无法及时处理，圈舍内氨气浓度高。羔羊免疫力低下，抗病力弱，吮乳时容易造成细菌感染，发生羔羊腹泻。急性腹泻能导致羔羊很快死亡，通过药物治疗后，病情得到一定控制，转为慢性腹泻，但羔羊生长受阻或生长停滞。在调研中发现，饲养管理和环境卫生状况是羔羊腹泻的主要诱因，有些养殖场羔羊腹泻的发病率为30%～100%，严重影响肉羊生产。另外羊场负责人只重视数量，忽视饲养管理和疾病防治，造成3月龄以内的羔羊腹泻反复发生，严重影响羔羊的生长发育和成年后的生产性能，且该现象在各个养殖场普遍存在。

3.2 分离菌的致病性

本试验从腹泻羔羊粪样中共分离出11株大肠杆菌和7株奇异变形杆菌，采用常规方法对细菌的形态特征、培养特性、生化特性进行鉴定，最终鉴定为大肠杆菌与奇异变形杆菌的混合感染，检测方法简单易行，不需高端仪器，在一般养殖场借助简单设备即可操作，但具有一定的主观因素，目前细菌鉴定的最好方法是PCR［3-5］。这两种菌均为条件性致病菌，即在一定的条件下能够致使羔羊发病，文献中对羔羊大肠杆菌性腹泻研究很透彻［6-7］，但对由奇异变形杆菌引起羔羊腹泻的报道不多。大肠杆菌分为非致病性和致病性两类，非致病性大肠杆菌是动物肠道正常菌，而致病性大肠杆菌能导致动物腹泻甚至死亡，鉴于试验条件，本次未做大肠杆菌血清型鉴定。奇异变形杆菌属于肠杆菌科变形杆菌属，为无荚膜、无芽孢的革兰氏阴性杆菌，该菌在自然界分布广泛，能存在于粪便、污水、土壤中，在一定条件下可引起多种动物感染，导致动物死亡［8］。

在本次试验中，用细菌培养液进行小鼠攻毒试验，结果表明，两种细菌均有致病性，奇异变形杆菌致病性弱于大肠杆菌，但混合感染致病性更高。从本次药敏试验结果可以发现，过去不太引起人们重视的细菌性疾病和条件致病菌感染，随着时间的推移和抗生素的滥用，其耐药性会在同一种属甚至在不同种属内进行传播和扩散，给临床治疗带来极大困难，如常用的氟哌酸、庆大霉素等药基本上属于中敏药物，甚至无效。因此，对其流行情况进行检测和耐药分析，可减少临床用药浪费，对指导临床合理使用抗菌药物非常有必要。

3.3 防治措施

加强饲养管理、消除诱因。对妊娠后期的母羊要供应充足的蛋白质和维生素饲料，对新生羔羊应及时饲喂初乳，以尽早获得母源抗体；助产时应加强消毒卫生，脐带用5%～10%碘酊浸泡，羊床要注意消毒。对发生过大肠杆菌病的养殖场可从本场分离致病菌，制作成自家大肠杆菌疫苗，结合本场情况制定合理的免疫程序，按时使用疫苗预防接种，可获得较好的防治效果。一旦发生羔羊细菌性腹泻，可在药敏试验基础上，选择高敏药物进行治疗，既能收到理想的治疗效果，又可降低生产成本，获取较高的经济效益；同时还可避免或减少耐药菌株的产生。在治疗时，以消除病因为主，辅以促消化，抗菌消炎，防止酸中毒，制止胃肠发酵和腐败，增强机体抵抗力。

［1］安俊卿，任志宏，刘晓倩，等．致羔羊腹泻大肠埃希菌的分离鉴定及防治［J］.畜牧兽医杂志，2013，32（1）:8-10.

［2］中华人民共和国卫生部.WS/T125—1999纸片法抗菌药物敏感试验标准［S］.北京：中国标准出版社，2000.

［3］于超，郭海勇，魏嘉良，等.16S～23S rRNA基因序列在细菌鉴定中的应用［J］.中国畜牧兽医，2012，39（2）：57-60.

［4］罗兆飞，张为宇，杨得胜.动物性食品中奇异变形杆菌PCR检测方法的研究［J］.福建畜牧兽医，2008（1）：1-3.

［5］王豪举，倪莉，杨红军，等.山羊奇异变形杆菌的分离鉴定及16S rDNA和ZapA基因的PCR-RFLP分析［J］.中国兽医学报，2011，31（11）：1594-1598.

［6］雷延慧，华洛加.羔羊腹泻的调查及综合防制［J］.中国畜牧兽医，2009，36（6）：175-177.

［7］喻华英，底丽娜.新疆羔羊腹泻病病原菌的分离鉴定和药敏试验［J］.中国兽医杂志，2012，48（5）：41-43.

［8］孙化露，卢艳，彭大新，等.3株鸽源奇异变形杆菌的分离与鉴定［J］.畜牧与兽医，2012，44（1）：68-70.

Isolation，Identification of Lam b Diarrhea Pathogens and the Screening of Sensitive Drugs

Tang Jishun，Hui Wenqiao，Chen Sheng，et al
（Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Anhui Academy of Agricultural Science，Hefei230031，China）

In order to isolate and identify the pathogens using conventional methods as well as select the useful drug treatment for lamb diarrhea，the 11 fecal samples from lambs with diarrhea were collected from the mutton sheep/goat farms in Hefei and Chuzhou city.11 samples of E.coli and 7 samples of Proteus mirabilis in the 11 fecal samples were detected，then the separated bacteria was purely cultured，biochemically identified，the drug sensitive test and the toxic pathogenic experiments in mice were carried out.The pathogenicity test showed that E.coli and Proteus mirabilis were virulent to mice，but the pathogenicity of Proteus mirabilis was weaker than that of the E.coli.The drug sensitivity test showed that enrofloxacin，florfenicol，kanamycin，amikacin，ceftriaxone，cotrimoxazole，norfloxacin propionate and cefazolin were effective to the seperated bacteria；gentamicin and norfloxacin a little effective，penicillin，streptomycin，clarithromycin and doxycycline ineffective.It is concluded that E.coli and Proteus mirabilis have certain pathogenicity，lamb diarrhea in these regions is caused by the mixed infection，and which is more pathogenic.

lamb diarrhea；E.coli；Proteus mirabilis；isolation and identification；drug sensitive test

S858.26

A

2095-3887（2016）04-0042-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.04.012

2016-05-28

安徽省农业科学院院长青年创新基金项目（15b0415）

汤继顺（1979-），男，助理研究员，主要从事肉羊繁育和疾病防治研究。

陈胜（1974-），男，副研究员，主要从事草食动物遗传育种与繁殖工作。