筋骨草总黄酮抗小鼠肝纤维化的作用机制

应雄，赖文芳，许力伟，宋百颖，苏燕青，南丽红

（福建中医药大学药学院，福建福州350122）

筋骨草总黄酮抗小鼠肝纤维化的作用机制

应雄，赖文芳，许力伟，宋百颖，苏燕青，南丽红

（福建中医药大学药学院，福建福州350122）

目的研究筋骨草总黄酮抗小鼠肝纤维化的作用机制。方法健康成年雄性昆明种小鼠60只，随机分为正常对照组、模型对照组、筋骨草总黄酮0.54 g／kg组（低剂量组）、筋骨草总黄酮1.08 g／kg组（中剂量组）、筋骨草总黄酮2.16 g／kg组（高剂量组），20%CCl4橄榄油溶液小鼠背部皮下注射，制作小鼠肝纤维化模型，Elisa法检测HA、PCⅢ、Ⅳ型胶原、LN的浓度，W estern Blot检测MMP-13、TIMP-1、SDF-1α、CXCR 4、GRP78、CRT蛋白表达水平。结果与模型对照组比较，筋骨草总黄酮3个剂量组能明显降低HA、PCⅢ、Ⅳ型胶原、LN含量，促进MMP-13的蛋白表达，抑制TIMP-1、SDF-1α、CXCR 4、GRP78、CRT蛋白表达，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论筋骨草总黄酮抗小鼠肝纤维化的机制是促进MMP-13，抑制TIMP-1、SDF-1、CXCR 4、内质网应激分子表达蛋白表达，使ECM沉积减少，抑制肝纤维化发生。

筋骨草总黄酮；肝纤维化；细胞外基质；基质金属蛋白酶；内质网应激

肝纤维化是肝脏对各种原因所致肝损伤的修复反应，其特征表现为肝内细胞外基质（extracellularmatric，ECM）过度合成、沉积，是慢性肝病发展为肝硬化的中间过程，也是发生肝癌的危险因素之一，是各种慢性肝病的共同病理过程。肝纤维化伴随着肝脏形态学和生物化学的改变，导致肝脏结构和代谢的异常［1］。肝星状细胞（haptic stellate cel1，HSC）是肝脏病理情况下ECM沉积的主要细胞来源，在纤维化发生、发展及转变中，处于中心细胞环节的地位。在肝脏病理情况下，HSC可分泌Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、Ⅳ型胶原、层黏蛋白（LN）、透明质酸（HA）等多种ECM成分，用以修补坏死脱落的肝组织缺损空间。基质细胞衍生因子（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）属于趋化因子CXC亚家族成员，CXCR4为其受体。研究发现，肝组织卵圆细胞增殖及外周血干细胞可促进肝组织再生，SDF-1和CXCR4基因在体内动员和活化中起到重要作用［2］。内质网应激（（endoplasmicreticulum stress，ERS）与慢性肝损伤尤其是肝纤维化的发生、发展具有相关性，钙网蛋白（calreticulin，CRT）与GRP78作为内质网分子伴侣蛋白［3］，目前对SDF-1、CXCR4、CRT与GRP78在肝纤维化肝组织中的研究尚少。

筋骨草为唇形科植物金疮小草（Ajuga Decumbens Thunb）的全草，性味苦寒，具有燥湿解毒、清热泻火、养筋活血的功效，对多种细菌具有抑制作用，其主要有效部位为黄酮类、研究表明筋骨草黄酮类具有改善肝细胞功能的保肝作用［4］。本研究通过检测ECM主要成分HA、PCⅢ、Col-Ⅳ和LN的含量，研究筋骨草总黄酮对小鼠肝纤维化的作用机制。

1　实验材料

1.1动物选取健康昆明种小鼠60只，雌雄各半，SPF级，体质量20～25 g，动物许可证号：SCXK（闽）2012-0001，福建中医药大学实验动物中心饲养。

1.2试剂筋骨草总黄酮（福建中医药大学药学院药学实验室，总黄酮含量为18.14%）；MMP-13多克隆抗体（批号：sc-30073）、TIMP-13多克隆抗体（批号：sc-21734）、SDF-1α多克隆抗体（批号：sc-28876）、CXCR4多克隆抗体（批号：sc-9046）、GRP78多克隆抗体（批号：sc-376768）、CRT多克隆抗体（美国santa cruz公司，批号：sc-8861）；β-actin（碧云天生物技术研究所，批号：H015）；HA（北京博奥森生物公司，批号：ER-1398）；PCⅢElisa试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：H212）；Ⅳ型胶原Elisa试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：H145）；LN Elisa试剂盒（上海信裕生物科技有限公司，批号：SEA082Mu）。

1.3实验仪器凝胶成像分析系统（美国Bio-rad公司）、高速台式冷冻离心机（美国Thermo Fisher公司）。

2　实验方法

2.1模型的制备用CC145 m L／kg在小鼠背部皮下注射，后用20%CCl4橄榄油溶液5 m L／kg在背部皮下注射，3 d 1次，实验期间小鼠自由饮水和进食。

2.2实验分组与处理昆明种小鼠60只，适应喂养1周后随机分为正常对照组、模型对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，于造模第4周，5组小鼠灌胃给药，按30 mL／kg分别给予生理盐水和筋骨草总黄酮。低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给予筋骨草总黄酮0.54 g／kg、1.08 g／kg、2.16 g／kg，每日1次，连续4周。末次给药2 h后，摘眼球取血，取肝组织冻存于液氮，备用。

2.3Elisa测定按试剂盒说明书检测血清HA、PCⅢ、Col-Ⅳ、LN相对含量。

2.4Western blot检测大鼠肝组织MMP-13、TIMP-1、SDF-1α、CXCR4、GRP78、CRT的蛋白表达提取总蛋白，用SDS-PAGE垂直板全湿法电泳，总蛋白经SDS-PAGE分离后，将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜，用封闭液封闭2 h后，加入稀释的一抗（MMP-13抗体1∶500、TIMP-1抗体1∶800、SDF-1α抗体1∶800、CXCR4抗体1∶800、GRP78抗体1∶300、CRT抗体1∶500、β-actin单克隆抗体1∶3 000，4℃下孵育过夜，次日TBS洗3遍，每次10 min，加入1∶1000稀释HRP标记二抗，室温下孵育2 h后TBS洗膜。加ECL试剂，经凝胶成像分析系统检测，分析目标条带的灰度值，计算3个给药组与空白对照组灰度值的比值，并统计各组之间的差异。

2.5统计学处理数据用x±s表示，用SPSS 20.0统计软件进行统计学处理，组间比较用t检验和单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3　结果

3.1筋骨草总黄酮对肝纤维化小鼠血清HA、PCⅢ、Ⅳ型胶原、LN含量的影响见表1。

3.2TFA对肝纤维化小鼠MMP-13和TIMP-1蛋白表达的影响见图1、表2。

3.3TFA对肝纤维化小鼠SDF-1α和CXCR4蛋白表达的影响见图2、表3。

3.4TFA对肝纤维化小鼠GRP78和CRT蛋白表达的影响见图3、表4。

表2　筋骨草总黄酮对MMP-13、TIMP-1蛋白表达的影响（x±s）

4　讨论

4.1HA、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、LN是ECM的主要成分，病理状态下HA、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ的表达为静止时的60～70倍。经TFA作用后，HA、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、LN含量显著降低。基质金属蛋白酶MMP-13是降解ECM的主要间质胶原酶，MMP-13主要受TIMP-1调控。我们发现经TFA不同浓度作用后，MMP-13蛋白表达明显上调，TIMP-1蛋白明显下调，结果表明筋骨草总黄酮可通过促进MMP-13、抑制TIMP-1蛋白表达，促进HA、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、LN含量降解，抑制细胞外基质积聚。

表3　筋骨草总黄酮对SDF-1α和CXCR4蛋白表达的影响（x±s）

表4　筋骨草总黄酮对GRP78和CRT蛋白表达的影响（x±s）

4.2SDF-1有2个亚型：SDF-1α和SDF-1β，它们是由同一基因编码的2种不同的拼接变异体，二者在表达及功能上无明显区别。人与小鼠的SDF-1有99%同源性，且CXCR4为SDF-1唯一受体。本研究发现模型对照组小鼠SDF-1和CXCR4表达升高，这部分是因为肝炎时，胆管上皮细胞及胆小管增生，淋巴细胞浸润，导致肝炎组织SDF-1和CXCR4表达升高，经不同浓度TFA作用后，SDF-1和CXCR4表达降低。研究表明，在肝细胞损伤时，蛋白质不能在肝细胞内正常折叠而引发内质网应激，在内质网应激反应过程中，会发生一系列细胞因子，如TGF-β等，细胞因子促使肝星状细胞产生胶原纤维，最终导致纤维化的发生［5］。内质网伴侣蛋白GRP78介导新生蛋白的加工成熟，是细胞蛋白质成熟、维系细胞功能和生命的关键性调节蛋白，被认为是内质网应激的标志性蛋白［6］。我们的研究表明在肝纤维化小鼠的肝组织中，GRP78、CRT蛋白表达水平显著升高，经筋骨草总黄酮不同浓度作用后，能够降低GRP78、CRT蛋白表达水平。

综上所述，用20%的CCl4橄榄油溶液建立的小鼠肝纤维化模型中，ECM含量异常增高，MMP-13、TIMP-1、SDF-1、CXCR4、内质网应激分子表达异常，参与了肝纤维化的发生。经TFA不同浓度作用后，能使ECM沉积减少，逆转相关基因的表达，抑制肝纤维化的发生。

［1］CHUN-HUI LI，LI-HUIPAN，ZONG-WEIYANG.ETPreventive effect of Qianggan-Rongxian Decoction on rat live fibrosis［J］. World Journal of Gastroenterology，2008，14（22）：3569-73.

［2］王庆国，严福华，徐鹏举，等.四氯化碳诱导小鼠肝纤维化模型中SDF-1α／CXCR4的表达及其意义［J］.中国实验动物学报，2009，17（5）：384-7.

［3］田慧群，吴薇，邹晓华，等.小鼠肝纤维化中内质网应激分子的表达与作用［J］.生物技术，2015，25（1）：71-4.

［4］赖文芳，陈燕，贾铷，等.筋骨草总黄酮对小鼠肝纤维化的影响［J］.福建中医药大学学报，2012，22（5）：46-47.

［5］TANJORE H，LAWSON W E，BLACKWELL T S.Endoplasmic reticulum stress as a pro-fibrotic stimulus［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1832（7）：940-7.

［6］MU YP，OGAWA T，KAWADA N.Reversibility of fibrosis，inflammation，and endoplasmic reticulum stress in the liver of rats fed a methionine-choline-deficient diet［J］.Lab Invest，2010，90（2）：245-56.

R285.5

B

1000-338X（2016）05-0013-03

2016-05-10

国家自然科学基金资助课题（81473382），福建省自然科学基金资助课题（2015J01328），福建中医药大学科技项目资助课题（X2013010）

应雄（1992—），男，2014级药理学专业硕士研究生，主要从事药理学研究。

南丽红（1985—），女，副教授。E-mail：13559102126@163. com