片仔癀对小鼠结肠癌细胞增殖及肝转移的抑制作用

郑良朴，曹治云，陈旭征，林薇

（1.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州350122；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122）

片仔癀对小鼠结肠癌细胞增殖及肝转移的抑制作用

郑良朴1，2，曹治云2，陈旭征2，林薇1，2

（1.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州350122；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122）

目的观察片仔癀对小鼠结肠癌细胞（CT26）增殖及肝转移的抑制作用。方法用MTT法观察片仔癀对CT26的增殖抑制作用，以BALB／c小鼠为研究对象，用脾脏注射法建立结肠癌CT26小鼠肝脏转移瘤模型，随机分为对照组、片仔癀组，观察各组小鼠的生存状态等一般情况，分析脾脏、肝脏成瘤情况，计算成瘤率。结果片仔癀对CT26增殖有明显的抑制作用，并呈剂量依赖关系；脾脏注射法成功建立CT26肝转移的动物模型，成瘤率100%，1周内对小鼠一般情况没有明显影响；片仔癀能抑制CT 26肝转移作用。结论脾脏注射法建立的CT26肝转移小鼠模型可用于结肠癌肝转移的研究，片仔癀对CT26增殖及肝转移有明显的抑制作用。

结肠癌；肝转移；片仔癀；细胞增殖；小鼠模型

为观察片仔癀对小鼠结肠癌细胞增殖及肝转移的抑制作用，我们做体外实验观察片仔癀对小鼠结肠癌细胞增殖抑制作用。用脾脏注射法制作结肠癌细胞肝转移的小鼠模型，观察片仔癀对小鼠结肠癌肝转移的抑制作用。片仔癀是有着400多年历史的中成药，由三七、麝香、牛黄、蛇胆等组成，具有清热解毒、散瘀止血、消肿定痛的功效，现已在消化道肿瘤等方面应用，有较好的疗效［1］，希望通过本实验为其临床应用提供实验依据。

1　实验材料

1.1实验仪器超净工作台（江苏省苏州净化设备公司）；CO2培养箱（德国Heraeus公司）；IX70倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；SXP-1C手术显微镜（上海医光仪器有限公司）；Elx808酶联免疫分析仪（美国Bio-Tek公司）；ME204E电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器公司）。

1.2药品与试剂片仔癀片剂（漳州片仔癀药业股份有限公司，规格：3 g／粒，批号：1203005）；5／0手术缝线（上海浦东金环医疗用品有限公司）；培养瓶、培养板（美国Coming公司）；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、DMEM高糖培养液、胎牛血清（FBS）、磷酸盐缓冲液（PBS）（美国Hyclone公司）；四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）干粉、二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司）。

1.3细胞株与动物小鼠结肠腺癌（CT26）细胞（中国科学院上海细胞库）。SPF级BALB／c雄性小鼠14只，体质量20～22 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号：SCXK（沪）2012-0002。

2　实验方法

2.1药物制备片仔癀片剂用研钵研成细粉，称取1 000 mg片仔癀粉末，用50%DMSO配制成浓度为50 mg／mL的20 mL，高压灭菌，4℃保存，待用于体外实验；称取3 000 mg片仔癀粉末，用双蒸水配制成浓度为30 mg／mL的100 mL，高压灭菌，4℃保存，待用于小鼠灌胃给药。

2.2细胞培养CT26用含1O%FBS的DMEM高糖培养液，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，在倒置相差显微镜下对细胞形态变化进行观察。

2.3CT26增殖抑制实验取处于对数生长期的CT26细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，调整细胞悬液浓度接种于96孔培养板，每孔加入100 μL细胞悬液，细胞密度为5 000／孔。孵育16 h后，使细胞同步化，加入不同浓度的50%DMSO溶解片仔癀，4组给药浓度为0、0.25、0.5、1 mg／mL，每组设8个复孔，以确保在培养体系中DMSO终浓度小于0.5%。继续孵育24 h，倒置显微镜下观察。小心吸去孔内培养液，每孔加入100μLMTT溶液，MTT溶液浓度为0.5 mg／mL，继续培养2 h。弃去MTT溶液，小心用PBS冲洗2遍后，每孔加入100μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶联免疫分析仪在570 nm处测量各孔的吸光度值（OD），计算抑制率。

2.4制作结肠癌细胞肝转移的动物模型BALB／c雄性小鼠称重，50 mg／kg体质量用1%的戊巴比妥钠进行腹腔内注射麻醉。麻醉成功后，用胶布固定小鼠于手术台上，安尔碘皮肤消毒，左侧腋后线肋缘下纵行切口，切口长1 cm，进腹后于腹外侧找到柳叶状脾脏，用无齿镊牵出腹腔外，用1 mL注射器从脾下极进针，注入指数生长期的CT26细胞液0.2 mL（约200 000个细胞），随后拔出针，用酒精棉球按压针眼，轻轻按揉脾脏5 min，使瘤细胞经脾静脉进入肝脏。注射区苍白隆起消失后，依次连续缝合肌肉、皮肤，关腹。术后在2级动物实验室饲养、观察。

2.5肝转移的抑制实验14只小鼠术后随机分为对照组和片仔癀组，每组7只。术后第2天，用灌胃方式给药，片仔癀组每只小鼠给片仔癀溶液每日1次，每次0.25 mL；空白组灌胃给等体积的饮用水。每日对小鼠毛发、大小便、活动等一般情况进行观察，连续给药7 d后，脱颈椎处死小鼠，剖腹观察肿瘤生长以及肝转移情况。

2.6统计学处理计量数据用x±s表示，用SPSS 13.0统计软件进行分析，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3　实验结果

3.1实验结果见表1、表2。

表1　片仔癀对CT26增殖抑制作用（x±s）

表2　片仔癀对脾脏注射CT26肝转移的作用

片仔癀对小鼠结肠癌细胞CT26有明显抑制作用，抑制率随着药物浓度增大而增大，差异具有统计学意义。2组小鼠的脾脏均有肿瘤形成，但腹腔未见肿大淋巴结。对照组6只小鼠肝脏中发现肿瘤结节，转移率为100%。片仔癀组中有2只小鼠肝脏中发现肿瘤结节，转移率为28.6%。

3.2一般观察动物造模后，随机分为对照组和片仔癀组，手术当日对照组小鼠死亡1只，解剖小鼠，分析死亡原因，属麻醉异常致小鼠死亡。后7天实验中，2组大鼠未见明显异常，饮食、活动等状况良好。

4　讨论

4.1结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年超过100万人诊断为结直肠癌，我国的结直肠癌发病率也呈逐年上升趋势［2-3］。结肠癌转移途径主要有血行转移、腹膜转移和淋巴结转移等，最常转移的器官是肝脏，而结直肠癌肝转移患者预后极差。因此，建立转移性结直肠癌动物模型是研究结直肠癌转移机制及抗肿瘤药物筛选的重要工具［4］。在结肠癌转移动物模型的研究中，由于人癌细胞难以在普通小鼠中生长，对模型动物及瘤源选择是作为重要因素进行选择。癌细胞脾脏内种植是目前研究肿瘤肝脏转移的最佳模式之一，CT26细胞具有较强侵袭能力，BALB／c小鼠常作为研究肿瘤肝脏转移的模型动物。本实验选用BALB／c小鼠作为模型动物，用具有转移高潜力CT26细胞作为瘤源细胞株进行脾脏注射方式造模，实验结果表明，脾脏注射法建立CT26肝转移的动物模型成瘤率达100%，可作为转移性结直肠癌的理想动物模型。

4.2中草药具有明显的肿瘤抑制作用［5－7］。本实验用MTT法观察片仔癀对CT26增殖抑制作用，实验结果表明，片仔癀对CT26有明显抑制作用，抑制率随着药物浓度增大而增大，呈剂量依赖关系；同时在片仔癀抑制CT26肝转移的实验中，片仔癀组明显低于对照组，转移率仅为28.6%。相关研究也表明，片仔癀对人结肠癌细胞和人脐静脉内皮细胞生长和增殖有明显抑制作用。抑制肿瘤细胞生长和增殖是抑制肿瘤转移作用机制之一，片仔癀如何通过抑制肿瘤细胞生长和增殖达到抑制CT26肝转移，还有待进一步研究。

［1］刘丛盛.片仔癀药理及临床应用综述［J］.医药世界，2006，8（S2）：64-65.

［2］SIEGEL R，MA J，ZOU Z H，et al.Cancer Statistics，2014［J］. Ca Cancer JClin，2014，64（2）：9-29.

［3］陈琼，刘志才，程兰平，等.2003～2007年中国结直肠癌发病与死亡分析［J］.中国肿瘤，2012，21（3）：179-182.

［4］孙钰，严卿莹，阮善明，等.转移性结直肠癌动物模型的研究进展［J］.肿瘤学杂志，2015，21（4）：335-339.

［5］魏丽慧，林久茂，彭军，等.片仔癀对人结肠癌细胞增殖的影响［J］.福建中医药，2010，41（1）：56-58.

［6］林薇，赵锦燕，郑良朴，等.片仔癀对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的影响［J］.福建中医药大学学报，2011，21（1）：25-27.

［7］靳祎祎，李琼瑜，赖子君，等.白花蛇舌草通过调控Hedgehog通路增加大肠癌耐药细胞的药物蓄积研究［J］.康复学报，2016，26（3）：34-39.

R285.5

B

1000-338X（2016）05-0016-02

2016-06-28

福建省自然科学基金资助课题（2014J013959、2015J01336）

郑良朴（1974—），男，高级实验师，主要从事中西医结合基础研究。

林薇（1974—），女，副研究员。E-mail：linwei3116@126.com