夏枯草乙醇提取物抑制人结肠癌细胞HCT-8增殖及诱导细胞凋亡

方翌，张铃，蔡巧燕，彭军

（福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122）

夏枯草乙醇提取物抑制人结肠癌细胞HCT-8增殖及诱导细胞凋亡

方翌，张铃，蔡巧燕，彭军

（福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122）

目的观察夏枯草乙醇提取物（EESP）对人结肠癌细胞HCT-8的增殖及凋亡的影响。方法MTT法检测细胞活力，Hoechst 33258检测细胞凋亡，GeXP系统分析EESP给药后细胞周期素D 2和周期蛋白依赖性激酶4的基因表达水平。结果EESP抑制HCT-8细胞活力呈剂量依赖效应，Hoechst 33258染色结果显示1 mg／m L的EESP诱导的HCT-8细胞核内呈现明显染色质凝聚等凋亡特征，GeXP系统分析发现EESP显著抑制CCND 2的水平，而CDK4与对照组比较无显著性差异。结论EESP诱导人结肠癌细胞HCT-8凋亡，通过抑制CCND2表达，干扰细胞周期素家族复合物的形成，抑制细胞增殖。

夏枯草提取物；结肠癌；GenomeLabTM遗传分析系统；细胞周期素D2

夏枯草、白花蛇舌草等中草药具有抑制肿瘤生长作用［1-4］。本研究从细胞周期相关基因入手，探讨EESP对HCT-8细胞增殖的抑制作用。前期研究发现夏枯草乙醇提取物能上调半胱氨酸蛋白酶家族caspase8、caspase9及bax的表达水平［5］，本研究用GeXP系统分析细胞周期素D2（cyclin D2，CCND2）和周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4），从细胞周期相关基因角度探讨夏枯草对人结肠癌细胞的影响。

1　实验材料

1.1仪器蒸汽灭菌器（上海市博迅有限公司）；RE-520A旋转蒸发仪（上海市亚荣生化仪器厂）；TDL-50B低速离心机（湖南省湘仪实验仪器开发有限公司）；CO2培养箱（香港利康仪器设备有限公司）；超净工作台（苏州市安泰仪器设备有限公司）；超微量高精度紫外／可见光分光光度计（美国Thermo公司）；E lx800酶标仪（美国基因有限公司）；IX70倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；PCR仪（美国Bio-Rad公司）；GeXP系统（美国Beckman Coulter公司）。

1.2试剂RPMI-1640培养基、胰蛋白酶、青霉素、链霉素（美国Hyclone公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；DNA聚合酶、MTT粉末（美国Sigma公司）；Hoechst33258染色试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；CEQTM分离凝胶、GeXP基因表达试剂盒（美国Beckman Coulter公司）。

1.3药物与细胞株夏枯草购于福建中医药大学国医堂中药房；结肠癌细胞株HCT-8（南京凯基生物科技发展有限公司）。

2　实验方法

2.1制备EESP研磨夏枯草全草，用85%乙醇溶解（100 g／L），过滤收集粗提液，旋转蒸发浓缩提取液，真空干燥后获得EESP干粉。以二甲基亚砜（DMSO）溶解干粉制备母液（0.6 g／mL），高压灭菌后-20℃保存备用。干预液的制备：培养基稀释母液，干预液DMSO最终浓度≤0.3%。

2.2细胞培养在500 mL的不完全RPMI-1640培养基中加入50 g的链霉素、500 U／mL的青霉素、55 mL的胎牛血清，0.22μm微孔滤膜过滤获得完全培养基。37℃、5%CO2、完全培养HCT-8细胞。

2.3药物干预胰酶消化对数生长期的HCT-8细胞，完全培养基重悬细胞，以1×105个／mL密度接种于96孔板（100μL／孔）或12孔板（1 mL／孔）中，37℃、5%CO2培养箱培养。当细胞汇合度达60%，用0、0.25、0.50、1 mg／mL的EESP干预细胞48 h。

2.4细胞活力检测吸去96孔板的各孔干预液，每孔加入0.25 mg／mL的MTT溶液200μL，37℃、5%CO2培养箱静置4 h。吸去MTT溶液，每孔加入DMSO 100μL，充分振荡15 min溶解结晶，570 nm处测吸光度值，计算细胞活力。

2.5Hoechst 33258检测细胞凋亡吸去12孔板的各孔干预液，PBS洗3次，每孔加入1 m L的4%多聚甲醛溶液，静置20 min。吸去各孔溶液，PBS洗3次。每孔加入1 mL的Hoechst33258染色液，避光反应20 min。吸去各孔溶液，PBS洗3次，最终每孔加入1 mL的PBS，荧光显微镜下观察拍照。

2.6RNA提取和定量以1 mg／mL的EESP干预HCT-8细胞后，用细胞刮刮下细胞，转移细胞及培养液到1.5 mL的离心管中，2 000 r／min离心5 min。离心后弃上清，PBS溶液漂洗沉淀3次，Trizol法提取细胞总RNA。20μL DEPC处理水溶解RNA，－80℃保存。用紫外分光光度计检测RNA的A260、A280值，计算其浓度与纯度。

2.7PCR扩增按照GeXP系统分析原则，设计CCND2、CDK4及3个内参TBP、B2M、GADPH的PCR引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。将引物配置成10μmol／L储存液，按1∶1混合500 nmol／L正向引物和200 nmol／L的反向引物获得正向与反向引物混合物。依次混合1.5μL的10 ng／μL RNA、1μL反向引物混合物、2μL的5×RT反应缓冲液、2.5μL KanR RNA、2.5μL DEPC处理水和0.5μL反转录酶，混匀后PCR仪上执行以下程序：48℃1 min，42℃1 h，95℃5 min，－80℃保存cDNA。取4.3μL的cDNA混入2μL的5×PCR反应缓冲液、1μL正向引物混合物、2μL的25 mmol／L的MgCL2和0.7μL Taq酶。扩增程序为：95℃3 min预变性，95℃30 s，55℃30 s，70℃ 1 min，35个循环。

2.8GeXP系统分析以DSS 400∶SLS＝0.2∶30混合，混匀后每个上样孔分装30μL的上样缓冲液，每孔上样1μL的PCR产物，以矿物油覆盖。加入250μL的分离液于样品板对应的分离液板孔中，放置样品板和分离液板。软件界面上设置上样顺序，电泳条件选择Frag-3，分析方法默认，放置胶条后运行程序。运行完成后，分析结果，以TBP、B2M、GADPH这3个内参乘积的3次方为内参，计算各组表达水平。

2.9统计学处理数据用x±s表示，用Excel 2003、SPSS 16.0软件处理数据，组间比较用Student's ttest分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3　实验结果

结果见表1、表2和图1。

表1　EESP抑制人结肠癌细胞HCT-8的细胞活力

表2　EESP对CCND2和CDK4表达水平的影响rfu

4　讨论

4.1EESP在0.50 mg／mL和1 mg／mL时，显著抑制HCT-8细胞活力，见表1。hoechst 33258染色发现活细胞核呈现出弥散均匀荧光，而凋亡细胞则在细胞核内可见浓染致密的颗粒块状荧光、染色质凝聚等特征，见图1。与0 mg／mL的EESP组比较，0.25 mg／mL EESP组细胞密度和细胞状态区别不大；0.5 mg／mL EESP组细胞密度变化不明显，出现个别凋亡细胞；1 mg／mL EESP组细胞密度明显减少，凋亡细胞比例较大，说明1 mg／m L的EESP能诱导HCT-8细胞凋亡。从表1和图1的结果看，1 mg／mL的EESP显著抑制HCT-8细胞活力且诱导细胞凋亡特征明显，故我们在结肠癌HCT-8细胞株中，以该浓度检测EESP干预下HCT-8细胞中CCND2和CDK4的表达水平，探讨EESP对HCT-8的细胞周期相关基因的影响。

4.2CCND2在EESP干预下，表达水平下调，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果显示EESP抑制CCND2基因表达，干扰细胞周期，抑制细胞增殖。CCND2是G1／S期特异表达的Cyclin D2的编码基因，该蛋白属于高保守性的细胞周期素家族，此家族的蛋白被作为标志物是因为它们在细胞周期的富集程度具有明显的周期性。作为细胞周期依赖性激酶的调节因子，它们的表达或降解与细胞有丝分裂的状态密切相关，由此影响细胞的增殖［6］。这些细胞周期素会组成一个复合物，作为CDK4或CDK6的调控亚基，在细胞周期G1／S期被激活。研究发现在EESP干预下，细胞周期素D2的基因表达显著下调，但CDK4无显著性差异，推测EESP通过抑制细胞周期素D2的基因，干扰细胞周期素家族复合物的形成，从而干扰细胞周期G1／S期，进一步导致细胞增殖的抑制。

［1］王锐，穆青.夏枯草的化学成分及生物活性研究［J］.天然产物研究与开发，2010，22（8）：219-225.

［2］KOIRALA N，THUAN N H，GHIMIRE G P，et al.Methylation of flavonoids：Chemical structures，bioactivities，progress and perspectives for biotechnological production［J］.Enzyme and Microbial Technology，2016，86：103-116.

［3］BAI L，CHIU C，CHU P，et al.A triterpenoid from wild bitter gourd inhibits breast cancer cells［J］.Scientific reports，2016，6（）：22419.

［4］靳祎祎，李琼瑜，赖子君，等.白花蛇舌草通过调控Hedgehog通路增加大肠癌耐药细胞的药物蓄积研究［J］.康复学报，2016，26（3）：34-39.

［5］方翌，张铃，林薇，等.夏枯草诱导人结肠癌细胞hct-8的凋亡［J］.福建中医药大学学报，2014，24（3）：46-48.

［6］SARITA RAJENDER P，RAMASREE D，BHARGAVI K，et al. Selective inhibition of proteins regulating cdk／cyclin complexes：Strategy against cancera review［J］.Journal of Receptors and Signal Transduction，2010，30（4）：206-213.

R284.2

B

1000-338X（2016）05-0011-03

2013-12-24

福建省自然科学基金资助课题（2014J01360）

方翌（1986—），女，理学硕士，助理实验师，主要从事中药抗肿瘤的作用机制研究。

彭军（1969—），男，研究员。Email：pjunlab@hotmail.com