红景天苷对局灶性脑缺血／再灌注大鼠脑组织Ephb3、Ephb6 mRNA表达的影响

许力伟，应雄，李茗菊，赖文芳，洪桂祝，张小琴

（福建中医药大学药学院，福建福州350122）

红景天苷对局灶性脑缺血／再灌注大鼠脑组织Ephb3、Ephb6 mRNA表达的影响

许力伟，应雄，李茗菊，赖文芳，洪桂祝，张小琴

（福建中医药大学药学院，福建福州350122）

目的研究红景天苷对局灶性脑缺血／再灌注大鼠的保护作用及对Ephb3、Ephb6mRNA的影响。方法SD大鼠36只，随机分为假手术组、模型对照组、红景天苷给药组，用线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型（MCAO），用Zea-Longa标准评分法评价大鼠神经功能损伤，TTC染色检测大鼠脑梗塞体积，RT-PCR法检测红景天苷对大鼠缺血侧脑组织的Ephb3、Ephb6 mRNA表达。结果与MCAO组比较，红景天苷能明显改善大鼠的神经功能损伤，降低脑梗塞体积，促进Ephb3、Ephb6m RNA的表达。结论红景天苷能降低MCAO模型大鼠的神经功能评分，减少脑梗塞体积，通过调节Eph受体介导神经元突触活动，对MCAO模型大鼠起神经保护作用。

红景天苷；脑缺血；再灌注；Ephb3；Ephb6；m RNA；神经保护

红景天苷是景天科植物红景天的主要有效成分，具有增强免疫、抗疲劳、耐缺氧、抗辐射、抗自由基损伤等多种药理作用［1］。我们课题组前期研究［2-5］发现红景天苷能降低缺血再灌注损伤大鼠的脑梗死体积和神经功能损伤，本研究旨在观察红景天苷对MCAO模型大鼠脑组织内促红细胞生成素产生肝细胞受体（erythropoie-tin-producing hepatocyte receptor，Eph）中Ephb3、Ephb6基因水平的影响，探讨红景天苷对MCAO模型大鼠的神经保护作用机制。

1　材料

1.1药品与试剂红景天苷（福建中医药大学药学院生物医药研发中心，纯度＞98%）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（美国Sigma公司）；SYBR Select Master Mix（美国Applied Biosystems公司）；RNeasy® Mini Kit（德国Qiagen公司）；逆转录试剂盒（美国Thermo公司）。

1.2PCR引物PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，参照Gen Bank中大鼠Ephb3、Ephb6、GAPDH的引物序列：

Ephb3引物上游序列5'-TCTCCCAAATCGTCAACACGC-3'；下游序列5'-CCACCGTCGTGAAGGTCGTAT-3'，PCR扩增片段长度为138 bp。

Ephb6引物上游序列5'-CGCCTTTGCCTCTTTTCCTG-3'；下游序列5'-TACGCCATCCTCCTCGGGTT-3'，PCR扩增片段长度为109 bp。

GAPDH引物上游序列5'-CAACGGGAAACCCATCACCA-3'；下游序列5'-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3'，PCR扩增片段长度为96 bp。

1.3实验动物SD大鼠36只，雄性，SPF级，体质量（260±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司［实验动物合格证号：SCXK（沪）2012-0002］，由福建中医药大学实验动物中心饲养［许可证号：SYXK（闽）2009-0001］，适应性饲养7 d后用于实验。

1.4仪器7900HT荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；DHP-9052电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；SK-1快速混匀器（常州国华电器有限公司）；PrimoR高速台式冷冻离心机（美国Thermo Fisher公司）；C1000 PCR仪（美国Bio-rad公司）。

2　方法

2.1分组及给药方法实验大鼠随机分成3组：假手术组、模型对照组（MCAO组）、红景天苷给药组（MCAO+Sal组），每组12只。同时，在缺血后分别腹腔注射生理盐水和红景天苷（100 mg／kg），连续给药6 d，末次给药2 h后，取脑，用于实验。

2.2造模大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL／kg体质量），沿颈部正中切开皮肤，暴露右颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈总动脉、颈外动脉。利用动脉夹夹闭颈内动脉，利用眼科剪将颈总动脉剪个小口，插入线栓，插入深度距动脉分叉2 mm，结扎颈内动脉。栓塞1.5 h后，将线栓丝拔出。假手术动物进行相同的操作，除了不栓塞中脑动脉。

2.3大鼠神经功能评分按照Zea-Longa神经行为缺损评分标准对大鼠进行评价。0分：无神经功能缺损；1分：提尾时右前肢内收，不能完全伸展；2分：自发行走时向右侧转圈；3分：行走时身体向右侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。神经功能缺损评分在1～3分为模型成功，评分至少由2人参与完成。

2.4脑梗塞体积检测采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法，取大鼠脑组织，用大鼠脑模具在大鼠脑组织视交叉处做冠状切片，厚度为2 mm，置于2%TTC的磷酸盐缓冲液中，避光37℃孵育30min。正常组织染成玫瑰红色，梗死体积则呈苍白色。染色后对组织进行拍照，利用Image-pro plus 6.0分析软件计算梗死体积。

2.5大鼠脑组织Ephb3、Ephb6基因检测根据trizol法提取大脑组织总RNA，用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，以cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测各基因的表达。PCR扩增反应条件为95℃预变性10 min，95℃变性15 s，退火60℃15 s，40个循环。以GAPDH为内参，计算2-ΔΔCt值。

2.6统计学处理数据用x±s表示，用SPSS 20.0统计软件进行分析，神经损伤评分分析用非参数检验，其余各组间数据比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3　结果

实验结果，见表1～表3。

表1　红景天苷对MCAO模型大鼠神经功能缺损评分的影响（x±s）

表2　红景天苷对MCAO模型大鼠脑梗死体积的影响（x±s）

4　讨论

4.1缺血性脑卒中是由于血栓或栓塞导致供血区域脑组织坏死，造成一系列神经功能缺损的疾病。突触是神经系统内进行信息传递的关键部位，其可塑性在神经系统的发育、成熟及学习记忆等生理功能中扮演着重要角色。Eph是受体酪氨酸激酶中最大的家族，主要分布在兴奋性突触。通过改变Eph／ephrin可以调节损伤后的突触功能，可以达到修复梗死灶、改善神经缺失功能。Ephb是Eph受体的亚类之一，其亚族包含Ephb1-6，能够与其配体Ephrin结合，调节神经系统发育，可直接参与细胞与细胞间的联系，介导轴突路径的引导、神经突触功能和可塑性的调节［6-7］。电针对脑缺血再灌注的神经损伤具有明显的改善作用［8－9］。

4.2红景天苷能够改善神经行为损伤，减少脑梗死体积，促进Ephb3、Ephb6基因的表达，提示红景天苷对缺血性脑损伤大鼠具有一定的神经保护作用，其保护作用与调节神经元突触活动有关。

表3　红景天苷对MCAO模型大鼠Ephb3、Ephb6m RNA的影响（x±s）

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R285.5

B

1000-338X（2016）05-0009-02

2015-07-07

国家自然科学基金资助课题（81473382），福建省科技厅重点项目资助课题（2014Y4004），福建省自然科学基金资助课题（2015J01685），福建中医药大学校管-科研创新平台专项资助课题（X2015009-平台）。

许力伟（1991—），男，2014级药理学专业硕士研究生，主要从事药理学研究。

张小琴（1986—），女，助理研究员。E-mail：582990886@qq. com