贝达葡萄酒中酵母菌的分离鉴定

谢俊云，姚 笛，郭 瑜，佐兆杭，张 微

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319）

贝达葡萄酒中酵母菌的分离鉴定

谢俊云，姚 笛，郭 瑜，佐兆杭，张 微

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319）

为了获得一株葡萄酒发酵后期的主导菌，试验对贝达葡萄酒中的酵母菌进行分离纯化，经菌落形态鉴定，并进行酵母分离株26S rRNA的PCR扩增，进一步通过基因序列分析进行鉴定。结果显示，贝达葡萄酒的酵母菌菌落总数为3.4×107CFU/mL，分离的酵母菌菌株Y3，Y5，Y13均为酿酒酵母。因此，贝达葡萄酒发酵后期的优势菌即为酿酒酵母。

贝达葡萄酒；酵母菌；鉴定

葡萄酒是目前世界上产量最大、普及最广的单糖酿造酒，是用葡萄果实或葡萄汁经过发酵酿制而成的酒精饮料［1］。葡萄酒具有养颜护肤、抗癌、抗衰老、抗辐射等功效，能够增进食欲、消除疲劳［2］。葡萄酒的发酵是多个酵母菌种及菌株互作生长和发展变化的复杂体系［3］。在葡萄酒发酵过程中，酵母菌的种群构成及变化对葡萄酒的风味和品质有重要影响，尤其是天然酵母的存在，对葡萄酒特色的形成极为重要。一般情况下，在自然发酵过程中，毕赤酵母属、假丝酵母属、梅奇酵母属等酵母菌可启动发酵，并在发酵中期逐步死亡和减少。酿酒酵母使发酵继续，直至完成［4］。

利用发酵中后期的优势菌作为菌种，发酵生产葡萄酒已成为葡萄酒生产的关键步骤。因此，筛选和鉴定葡萄酒发酵中后期的主导菌对于葡萄酒的生产具有重要意义。所以，寻找能够适应当地葡萄原料特性，且有利于形成地域葡萄酒风格的新酵母菌株已成为研究的焦点［5-6］。目前，序列的同源性分析已被广泛用于酵母种属水平的鉴定等［7］。本研究拟对大庆市葡萄产区的贝达葡萄酒中的酵母菌进行分离纯化，并运用分子生物学技术对酵母分离株进行鉴定，鉴定出的酵母分离株旨在为葡萄酒生产菌种资源的进一步利用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料

贝达葡萄酒，由黑龙江八一农垦大学食品加工实验室自酿。

1.1.2 主要试剂和培养基

纤维素酶、溶菌酶、琼脂糖、胶回收试剂盒、dNTP和TaqDNA聚合酶，购自大连Takara公司；YPD琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基等，青岛海博公司产品；氯化钠、饱和酚、乙醇、氯仿、异戊醇、异丙醇、EDTA和Tris等，均为国产分析纯。

1.1.3 引物

根据Genebank发表的酵母菌26S rRNA基因序列，利用Primer 5设计引物，引物序列如下，F:5'-G GCTTTAAGTGAGTTGATTG-3'，R:5'-TTGCCAGCATC CTTGACTTA-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.4 培养基

YPD培养基按照说明书配制，121℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.1.5 主要仪器与设备

EDC-810型PCR扩增仪，东胜创新生物科技有限公司产品；JY04S型凝胶成像系统，北京君意东方电泳设备有限公司产品；XD-30A型生物显微镜，宁波舜宇仪器有限公司产品；DRP-9082型电热恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司产品；YX-280D型压力蒸汽灭菌器，合肥华泰医疗设备有限公司产品；NW10UF型水纯化系统，HealForce产品；TGL-16B型离心机，上海安亭科学仪器厂制造产品。

1.2 方法

1.2.1 葡萄酒中酵母菌总数的测定

YPD培养基冷却至50～60℃时，加入青霉素G钠和链霉素溶液，以防细菌的生长。取25 mL葡萄酒样品于含225 mL无菌生理盐水的三角瓶中，然后将葡萄酒样品进行10倍系列稀释，取1×10-4～1× 10-6的样品液1 mL倾注接种，倾入YPD培养基，每个稀释度做2个平行，待凝固后28℃培养5 d后进行菌落计数。

1.2.2 葡萄酒中酵母菌的分离

取上述葡萄酒样品的稀释液于灭菌平皿中，倾入YPD培养基，置28℃下恒温箱中培养，每24 h观察1次，对培养基上长出的疑似酵母菌菌落进行纯化培养，镜检为纯种后接入YPD固体培养基斜面，于4℃下低温保存。生长的酵母菌菌种用阿拉伯数字Y1，Y2，Y3，Y4……依次编号。

1.2.3 酵母菌分离株的形态学鉴定

对纯化培养的酵母菌单菌落进行形态学观察，然后取分离得到的单菌落进行染色，酵母菌采用番红进行染色。在载玻片上滴1滴蒸馏水，用接种环取一环菌体，均匀涂布于载玻片上，用火焰进行干燥固定，番红染色1～2 min，经水洗、干燥，显微镜观察微生物个体形态。

1.2.4 酵母菌分离株的分子鉴定

（1）葡萄酒中酵母菌分离株的DNA提取。葡萄酒中酵母菌基因组DNA的提取，按《分子生物学手册》中常规方法的改进方法进行。

具体如下：取葡萄酒中酵母分离株的单个菌落接入YPD液体培养基中，以转速200 r/min，温度28℃培养过夜，取适量菌体，加入少量DNA提取缓冲液（100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris，1.5 mol/L NaCl，pH值8.0） 于1.5 mL离心管中，加入纤维素酶和溶菌酶（终质量浓度分别为6，1 mg/mL），混合均匀后于37℃下水浴1.5～2 h。加入20%SDS100 μL，于65℃下水浴30～60 min，以转速12 000 r/min离心10 min。取上清液加入等体积酚、氯仿和异戊醇混合液（体积比为25∶24∶1）并混匀，以转速12 000 r/min离心10 min。取上清液并加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置20 min，以转速12 000 r/min离心10 min。弃上清液，用70%乙醇洗涤，以转速12 000 r/min离心10 min。干燥后用50 μL ddH2O溶解，DNA样品于-20℃下保存。

（2）26S rRNA基因的PCR扩增。以26S rRNA的F，R引物扩增提取的葡萄酒中酵母分离株的基因组DNA，PCR反应体系为10×2.5 μL，dNTP 2.0 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，Taq酶0.2 μL，加ddH2O至25 μL。PCR扩增条件为94℃5 min，94℃45 s，54℃50 s，72℃60 s，做30个循环，于72℃下延伸10 min，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

（3）目的片段的回收与纯化。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色。紫外灯下分别切下含有目的片段的凝胶块，置于1.5 mL EP管中。利用DNA纯化回收试剂盒对目的片段进行回收和纯化，具体方法按照操作说明书进行。

（4）26S rRNA基因的序列分析。将已纯化的PCR产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，得到菌株PCR扩增片段的基因序列。在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索（BLAST search），比较分离株与已知微生物相应序列的同源性，确定分离株的分属。

2 结果与分析

2.1 贝达葡萄酒中酵母菌的计数

对贝达葡萄酒样品进行酵母菌的菌落总数测定，测得的酵母菌菌落总数为3.4×107CFU/mL。

2.2 酵母菌的形态学观察结果

酵母菌的菌落特征为圆形、大而厚，菌落表面光滑、湿润、黏稠，与培养基结合不紧密，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落为乳白色。

分离株Y3的菌落形态见图1，分离株Y3的镜检形态见图2。

图1 分离株Y3的菌落形态

酵母菌细胞呈球形、椭圆形，生殖方式为芽殖，无假菌丝，无色素；其他酵母菌分离株的菌落形态和镜检形态均与Y3相似。

图2 分离株Y3的镜检形态

2.3 葡萄酒中酵母菌的PCR扩增结果

对分离的3株酵母菌Y3，Y5，Y13进行了26S rRNA基因的PCR扩增。

酵母分离株的PCR扩增效果见图3。

图3 酵母分离株的PCR扩增效果

由图3可知，获得了与预期大小相符的PCR扩增产物，片段大小为300～400 bp。

2.4 PCR扩增产物的回收与纯化

利用DNA纯化回收试剂盒对PCR扩增片段进行回收和纯化。

酵母分离株的PCR扩增产物纯化结果见图4。

图4 酵母分离株的PCR扩增产物纯化结果

由图4可知，获得的目标产物与预期大小相符，片段大小为300～400 bp，无引物二聚体。

2.5 酵母分离株的26S rRNA序列分析

对酵母分离株的26S rDNA基因序列进行BLAST

同源性比较，代表菌株Y3的26SrRNA基因序列分析。酵母菌分离株Y3的序列分析结果见图5。

图5 酵母菌分离株Y3的序列分析结果

由图5可知，酵母菌分离株Y3与酿酒酵母菌株的同源性为99%以上，可将Y3鉴定为酿酒酵母；Y5和Y13的序列分析结果与Y3相同，均为酿酒酵母。因此，说明贝达葡萄酒发酵后期的优势菌即为酿酒酵母。

3 结论

葡萄酒的生产需要微生物的参与，在此过程中发生了一系列复杂的生物化学变化，使制品具有特定的风味和营养。酵母是葡萄酒发酵中后期的主导菌。本试验对贝达葡萄酒中的酵母菌进行分离纯化，通过形态学观察和分子生物学方法对酵母分离株进行鉴定。结果显示，贝达葡萄酒的酵母菌菌落总数为3.4×107CFU/mL，分离的酵母菌菌株Y3，Y5，Y13均为酿酒酵母，因此贝达葡萄酒发酵后期的优势菌即为酿酒酵母。

［1］翟蘅，杜金华，管雪强，等.酿酒葡萄栽培及加工技术 ［M］.北京：中国农业出版社，2005：147-151.

［2］顾沛雯，张军翔.葡萄酒酵母检测方法研究 ［J］.葡萄酿酒，2005（3）：38-40.

［3］苏龙，刘树文，何玲，等.东北山葡萄酒自然发酵酵母菌群的研究 ［J］.食品与生物技术学报，2007，26（3）：110-115.

［4］刘慧.现代发酵微生物试验技术 ［M］.北京：化学工业出版社，2005：60-67.

［5］刘小珍，张汉尧.昆明葡萄酒相关酵母菌的分离与鉴定 ［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2014，42（5）：78-81.

［6］朱丽霞，李红梅，郭东起，等.新疆慕萨莱思自然发酵过程中酵母菌表型多样性及优势菌分析 ［J］.食品科学，2012，33（7）：142-147.

［7］Dlauchy D，Tornai-Lehoczki J，Peter G.Restriction enzyme analysis of PCR amplified rDNA as a taxonomic tool in yeast identification［J］.Systematic and Applied Microbiology，1999，22（3）：445-453.◇

Separation and Identification of Yeast in Beida Grape Wine

XIE Junyun，YAO Di，GUO Yu，ZUO Zhaohang，ZHANG Wei
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

In order to obtain a dominant yeast strains at later stage of grape wine fermentation，isolation and purification of yeast in beida grape wine is performed and colony morphology is identified.Then PCR amplification of 26S rRNA of yeast isolates is conducted，further identification by gene sequence analysis.Results show that yeast colony number in beida grape wine is 3.4×107CFU/mL，the yeast isolated strains Y3，Y5，Y13 are saccharomyces cerevisiae.Therefore，the advantage yeast in grape wine later fermentation is saccharomyces cerevisiae.

beida grape wine；yeast；identification

TS262.61

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.01.006

2015-11-12

谢俊云（1993— ），男，本科，研究方向为食品加工。