辐照杀菌全蛋液贮藏期间抗氧化物活性及过敏源特性变化分析

戴 妍，韩兆鹏，范 蓓，卢 嘉，卢晓明

（1.北京德青源农业科技股份有限公司，北京 102115；2.中国农业科学院原子能利用研究所，北京 100193）

辐照杀菌全蛋液贮藏期间抗氧化物活性及过敏源特性变化分析

戴 妍1，韩兆鹏1，范 蓓2，卢 嘉2，*卢晓明1

（1.北京德青源农业科技股份有限公司，北京 102115；2.中国农业科学院原子能利用研究所，北京 100193）

研究了对照组、巴氏杀菌组和辐照杀菌处理组（2，4，6 kGr）对4℃贮藏期间（0，10，20 d）全蛋液抗氧化物活性及卵白蛋白过敏源特性变化影响，抗氧化物活性指标包括羟自由基清除能力、DPPH自由基抑制率和还原力等指标。结果显示，辐照杀菌处理组（2，4，6 kGr）全蛋液在第10天时DPPH自由基和羟自由基抑制率显著高于对照处理组（p＜0.05）；第0天和第20天辐照杀菌2 kGr处理组巯基含量与对照组和巴氏杀菌处理组之间无显著差异（p＞0.05）；SDS-PAGE和Western-blot结果表明，贮藏期间辐照杀菌处理并没破坏全蛋液中重要过敏源——卵白蛋白。

辐照杀菌；DPPH自由基抑制率；羟自由基清除能力；过敏源；全蛋液

0 引言

食品辐照杀菌（Food irradiation sterilization）——“冷巴氏杀菌”技术是指经一定剂量电离射线60Coγ或137Csγ射线或电子加速器产生的电子束（最大能量10 Mev） 或X射线（最大能量5 Mev）的辐照，杀灭食品中的害虫，消除食品中的病原微生物及其他腐败细菌或抑制某些食品中的生物活性和生理过程，从而达到延长食品保质期或达到食品保鲜的目的［1］。现在已经证明，食品辐照杀菌技术是一种有效安全的食品加工方法［2］。自20世纪80年代以来，食品辐照杀菌技术已被成功地应用于杀灭香辛料、鲜蔬食品、冷冻虾、粮食、畜产品中的微生物等［2-7］。

液蛋产品是将新鲜鸡蛋去壳，经过加工处理包装后的蛋制品总称［8］。目前，液态蛋杀菌通常采用巴氏杀菌方式，这种杀菌方式会使蛋液中的营养成分和功能特性被破坏，而且并不能有效抑制微生物的污染［9］。黄小波等人［4］认为，全蛋液采用0.4～0.6 kGr剂量辐照杀菌处理，能够在0～4℃条件下延长全蛋液保鲜期；采用0.4 kGr剂量的辐照杀菌技术处理，对蛋清蛋白液各项理化指标影响不大［3］。食品过敏特性及抗氧化特性是影响食品品质和安全的重要因素，鸡蛋、牛奶以及坚果类等是食品原料中主要的过敏源，容易引发人体不良反应［10］。国内外研究表明，食品中的抗氧化物对控制食品酸败产生、延迟有毒氧化物生成、维持营养品质以及延长食品的货架期［11］发挥了重要的作用。

目前，国内外学者研究高密度CO2杀菌处理对蛋白液抗氧化物活性和过敏特性的影响仍属空白。通过设计一组试验，分别对全蛋液进行如下处理：对照组（不经过任何杀菌处理）；巴氏杀菌（66℃杀菌3.5 min） 处理；辐照处理采用60Coγ辐射源，辐照剂量分别设为2，4，6 kGr。处理完毕后，将蛋液在4℃条件下贮藏，对0，10，20 d的全蛋液抗氧化特性及过敏特性变化进行初步分析。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

三羟甲基氨基甲烷、5，5-二硫二硝基苯甲酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、十二烷基硫酸钠、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、过硫酸铵、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺、甘油、β-巯基乙醇、溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250、DPPH、吐温-20、鸡卵白蛋白（Ovalbumin）抗体、AP-IgG兔抗鸡抗体（Amresco，美国）；Urea（Sigma，美国）；lowery蛋白试剂盒、BCIP试剂盒，以及牛血清白蛋白BSA等购于北京索来宝公司；其他试剂均为分析纯。

电子天平；Shimadzu UV-1780型紫外可见分光光度计，日本岛津产品；SL-Ⅲ型低温层析冷柜、Eppendorf移液器，美国Eppendorf公司产品；XHF-D型匀浆机、H1850R型高速冷冻离心机、BG电泳仪以及转印芯、硝酸纤维素膜，北京索来宝公司产品；Tocan gelation image system型凝胶成像仪，南京生物技术公司产品；TS-2型脱色摇床，金坛仪器有限公司产品；Biolabs P7710型蛋白Marker，北京百灵克公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 原料处理

全蛋液：将壳蛋去壳后，倒入干净的烧杯中，用XHF-D型匀浆器进行匀浆（以转速3 000 r/min匀浆30 s），然后直接放入真空包装袋中封口。对照组直接放入4℃冷柜中贮藏备用；巴氏杀菌处理组直接将包装袋封口的全蛋液放入66℃水浴锅，杀菌3.5 min后取出，冷却到室温，然后放入4℃冷柜中贮藏备用；辐照杀菌处理组将全蛋液（真空包装）送至中国农业科学研究院辐照中心处理，采用60Coγ辐射源，用重铬酸银剂量计进行剂量跟踪，辐照剂量设为2，4，6 kGr，每个处理组使用4份全蛋液样品。处理后的样品放入4℃冷柜中贮藏备用，取0，10，20 d的贮藏样品进行相关指标的检测分析［4，6］。

1.2.2 全蛋液样品的游离巯基（-SH） 含量（Free sulfhydryl content） 分析［12］

全蛋液溶液（0.5 mg/mL） 与Tris-Gly缓冲液（0.086 mol Tris，0.09 mol/L Gly，0.04 mol/L EDTA，8 mol/L Urea）混合，10 000×g离心10 min（4℃），取上清液，测游离巯基（-SH）的含量：取2 mL上清液加入80 μL Ellman's试剂（4 mg/mL DTNB）后立即混匀，5 min后于412 nm处测吸光度。游离巯基的计算公式如下：

Free sulfhydryl content（-SH）=（73.53×A412）/C（μmol/g蛋白质）。

1.2.3 全蛋液样品的羟自由基（·OH）清除能力（%）分析

羟自由基（·OH）清除能力的测定方法参考杨瑾等人［12］的方法，具体如下：全蛋液样品蛋白质量浓度用蒸馏水稀释至5 mg/mL，蛋白质量浓度用lowery蛋白试剂盒测试。将稀释后的蛋液用南京建成羟自由基测定试剂盒进行羟自由基（·OH）清除能力（%）的分析，550 nm比色。

羟自由基（·OH）清除力（%）=［对照组OD-测定值OD/对照组OD］×100%.

1.2.4 全蛋液样品的DPPH自由基抑制率分析

全蛋液样品的DPPH自由基抑制率参考文献［13］。全蛋液（0.10 g）迅速与3 mL 0.004%DPPH-乙醇溶液混合，振荡摇匀。在室温下放置30 min后，以无水乙醇为空白对照，于517 nm处测定吸光度。吸光度越小，代表其清除DPPH自由基能力越强。

1.2.5 全蛋液样品的还原力分析

全蛋液样品的蛋白质量浓度用蒸馏水稀释至0.5 mg/mL，蛋白质量浓度用lowery蛋白试剂盒测试。取样品溶液2 mL，加入 2 mL1%的K3（CN）6溶液，置于50℃的水浴锅中反应80 min，迅速冷却后离心（3000×g，10 min，20℃），取上清液2 mL，加入2 mL去离子水和0.5 mL质量分数为0.1%的FeCl3溶液，混合均匀后静置60 min，于700 nm处测定吸光度。吸光度越大，说明样品的还原力越强［14］。

1.2.6 全蛋液样品过敏特性分析

特异性过敏源卵白蛋白（Ovalbumin） 的SDSPAGE以及Western blot分析：取全蛋液（0.5 g），加入20 mL蒸馏水，然后使用XHF-D型匀浆机搅拌。搅拌后的蛋液用lowery试剂盒进行蛋白质浓度分析。将全蛋液稀释至质量浓度为1 mg/mL，然后进行SDS-PAGE分析。

SDS-PAGE采用的分离胶质量分数为12%，浓缩胶质量分数为4%。将全蛋液样品按1∶5与样品缓冲液（含有2%SDS，10%甘油，1%β-巯基乙醇，pH值为6.8的Tris-HCl以及0.05%溴酚兰）混合，混合后的样品液置于100℃沸水中加热5 min。取大约含20 μg的蛋清蛋白液上样（同时使用北京百灵克公司biolabs P7710蛋白marker做对照）。凝胶用小型的BG蛋白电泳仪做分离，采用恒流模式（30 mA）保持2.5 h后，取出凝胶，用硝酸纤维素膜进行BG转印芯湿转（转移缓冲液：Tris 3.03 g，glycine 14.4 g，200 mL甲醇，用去离子水定容至1 L）。转印电压100 V湿转2 h后，用TBST1清洗20 min（TBST1，每 500 mL TBS加入 0.5 mL Tween 20；TBS，Tris 1.211，NaCl 8.76 g，1 mol/L HCl调pH值至7.5，去离子水定容至1 L），用封闭液（TBS 50 mL，Tween 20 25 μL，BSA 1.5 g） 进行封闭。封闭后再用TBST1进行清洗，用封闭液1∶500稀释1抗（Rabbit anti-ovalbumin），对硝酸纤维素薄膜进行室温免疫（1 h），然后用TBST1进行清洗，在用封闭液1∶5 000稀释的2抗AP-rabbit IgG室温免疫1 h，最后用TBST2（Tris 3.03 g，NaCl 4.38 g，Tween 20 0.5 mL，用HCl调pH值为7.5，定容至500 mL）进行清洗，最后加入底物显色剂BCIP试剂盒进行显色与照相［15-16］。

1.2.7 数据处理

用SPSS 16.0数据分析软件对各指标进行分析，Unpaired Student T-test用于分析各处理组全蛋液各指标显著性差异（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 全蛋液样品游离巯基（-SH）含量分析

全蛋液贮藏期间游离巯基（-SH）含量变化见图1。

图1 全蛋液贮藏期间游离巯基（-SH）含量变化

在0～20 d贮藏期间，各处理组游离巯基（-SH）含量呈现先减少后增加的趋势。对照组、辐照杀菌处理组（2，4，6 kGr）蛋液在第10天游离巯基（-SH）含量（5.48～8.14 μmol/g） 显著低于（p＜0.05） 其他贮藏期间游离巯基（-SH）含量。当贮藏期达到第20天时，所有处理组游离巯基（-SH） 含量（18. 19～23.63 μmol/g）达到最大。本试验的研究结论与刘文营［17］对蛋清蛋白液贮藏期间游离巯基的变化趋势相吻合。

在10～20 d贮藏期间中，辐照杀菌 4 kGr和6 kGr处理组游离巯基（-SH） 含量分别为（5.48，19.97 μmol/g） 和（6.31，18.19 μmol/g） 显著低于（p＜0.05） 巴氏杀菌处理组（11.88，23.63 μmol/g）。食品中蛋白质氧化可能伴随着游离巯基（-SH）含量的减少［18］，由于辐照杀菌剂量高于2 kGr时，可能会导致全蛋液中蛋白质氧化加剧，蛋白质之间交联程度增加，蛋白质发生更大强度的变性与水解等，使得全蛋液游离巯基（-SH）含量的显著减少［4，17］。

2.2 全蛋液样品羟自由基（·OH）清除率（%）分析

全蛋液贮藏期间羟自由基（·OH）清除率含量变化见图2。

图2 全蛋液贮藏期间羟自由基（·OH）清除率含量变化

游离羟基（·OH）的产生可能与生理和病理现象紧密相关。羟自由基（·OH）清除率越高，越容易抑制食品酸败和细胞癌变的发生［19］。在0～20 d贮藏期间，各处理组羟自由基（·OH）清除率（%）呈现出相应减少的趋势。原因可能是4℃贮藏期间全蛋液羟自由基抑（·OH）制作用弱于氧化作用，引起相应抗氧化活性能力的下降［19］。第0天时，对照组和巴氏杀菌处理组羟自由基（·OH）清除率（%）分别为79.29%和79.87%，显著高于所有辐照杀菌处理组（2，4，6 kGr） （p＜0.05）。第10天时，辐照杀菌处理组（2，4，6 kGr）羟自由基（·OH）清除率显著高于对照组（37.26%） 和巴氏杀菌处理组（37.50%） （p＜0.05）。第20天时，各组均无显著性差别（p＞0.05）。对照组和巴氏杀菌处理组蛋液羟自由基（·OH）清除率下降较为明显，试验结果表明随着贮藏时间的推移，对照组和巴氏杀菌处理组全蛋液中抗羟基氧化的能力可能在某种程度上低于辐照杀菌处理组。

2.3 全蛋液样品DPPH自由基抑制率分析

全蛋液贮藏期间DPPH抑制率分析见图3。

图3 全蛋液贮藏期间DPPH抑制率分析

食物中DPPH自由基抑制率也是体现抗氧化活性的一个重要指标，DPPH吸光度的下降体现DPPH自由基抑制率的增强［20］。在0～20 d贮藏时间中，对照组、巴氏杀菌组、辐照杀菌处理组（2，4，6 kGr）蛋液样品中DPPH抑制率呈现出先升高后下降的趋势，这与Huang B等人［13］研究贮藏期猪肉的DPPH自由基变化趋势一致。原因可能是由于贮藏期间全蛋液氧化作用弱于水解作用，能够生成更多的DPPH自由基抑制产物［21］。第10天时，辐照杀菌处理组（2，4，6 kGr）DPPH自由基抑制率的吸光度达到最大值（0.53～0.57），显著高于对照组。第20天时，所有处理组之间无明显差别。

2.4 全蛋液样品还原力分析

全蛋液贮藏期间还原力分析见图4。

图4 全蛋液贮藏期间还原力分析

还原力也是表征食品抗氧化活性的相关指标，食品中还原力吸光度越高，其抗氧化能力越强［20］。随着贮藏时间的延长，所有样品处理组还原力呈现出下降的趋势。第20天，所有处理组样品还原力值（0.45～0.47）显著低于（p＜0.05）第0天同样的样品（0.63～0.65）；第0天，辐照杀菌6 kGr处理组还原力值（0.65）显著高于（p＜0.05）对照组（0.63）。其余贮藏期各处理组无显著差异。

图5 贮藏期间对照组、巴氏处理组、辐照杀菌处理组（2，4，6 kGr）全蛋液电泳分析

图6 贮藏期间对照组、巴氏处理组、辐照杀菌处理组（2，4，6 kGr）全蛋液Western-blot分析

2.5 全蛋液样品过敏特性分析

贮藏期间对照组、巴氏杀菌组、辐照杀菌处理组（2，4，6 kGr）全蛋液电泳分析见图5，贮藏期间对照组、巴氏杀菌组、辐照杀菌处理组（2，4，6 kGr）全蛋液Western-blot分析见图6。

图5和图6分别表示对照组、巴氏杀菌组、辐照杀菌处理组（2，4，6 kGr）全蛋液SDS-PAGE和Western-blot分析。全蛋液蛋白质主要电泳条带有4条，分子量分别为130，90，60，45 kDa，试验结果与郝丽芳［22］研究的全蛋液主要蛋白质电泳条带结果基本吻合。蛋液中的卵黏蛋白（250 kDa）、卵转铁蛋白（78kDa）、卵白蛋白（43 kDa）和溶菌酶（14.3 kDa）是前人所鉴定出的主要过敏源［23-25］，试验全蛋液中鉴定出的过敏源可能为卵黏蛋白（250 kDa）、卵转铁蛋白（78 kDa）和卵白蛋白（43 kDa），而最为主要的过敏源蛋白质为卵白蛋白（Ovalbumin）。当贮藏天数超过10 d后，所有处理组全蛋液蛋白质的其他“杂”蛋白（＞80 kDa，＜40 kDa）也能够为IgG抗体所识别，表明所有处理组蛋液过敏特性增强，贮藏期间所有处理组过敏源卵白蛋白（Ovalbumin；43 kDa）并未发生明显变化。

3 结论

在4℃贮藏期间对照组、巴氏处理组以及辐照杀菌处理组（2，4，6 kGr）全蛋液清液游离巯基（-SH）含量与DPPH自由基抑制率呈现出升高的趋势，而还原力和羟基（·OH）清除率（%）则出现了缓慢下降。第10天，辐照杀菌处理组（2，4，6 kGr）的羟自由基（·OH）清除率和DPPH自由基抑制率显著高于（p＜0.05）对照组。辐照2 kGr杀菌处理组巯基含量略高于辐照4 kGr和6 kGr杀菌处理组，所有处理组过敏源卵白蛋白（Ovalbumin）过敏特性有抗原特性无显著性差别，因此采用辐照杀菌技术并没有破坏全蛋液中重要过敏源（卵白蛋白）。

［1］王锋，哈益明，周洪杰，等.辐照对食品营养成分的影响 ［J］.食品与机械，2005，21（5）：52-55.

［2］高美须，陈浩，刘春泉，等.食品辐照技术在中国的研究和商业化应用 ［J］.核农学报，2007，21（6）：606-611.

［3］黄小波，马美湖，李文革.辐照杀菌对鸡蛋蛋白液特性的影响 ［J］.农业工程学报，2009，25（5）：244-248.

［4］黄小波，马美湖，傅鹏，等.液态蛋全蛋液辐照冷杀菌技术的研究 ［J］.食品科学，2008，29（3）：216-219.

［5］段鑫，欧杰，李柏林.辐照技术在肉制品杀菌保鲜中的应用 ［J］.食品科学，2010，31（1）：278-282.

［6］刘超超.辐照对鲜切蔬菜品质影响的研究 ［D］.北京：中国农业科学院，2013.

［7］李光涛，曹阳，孙辉，等.辐照技术在储粮害虫防治中的应用 ［J］.粮食储藏，2007，36（2）：10-16.

［8］张铭东.液态蛋杀菌工艺及其功能性质的研究 ［D］.哈尔滨：哈尔滨商业大学，2015.

［9］刘彭，张佳程，孙宝忠，等.基于液态蛋研究中存在问题及对策的探讨 ［J］.食品科技，2009，34（8）：56-59.

［10］Khuda S E，Jackson L S，Fu T J，et al.Effects of processing on the recovery of food allergens from a model dark chocolate matrix［J］.Food Chemistry，2015，168（1）：580-587.

［11］Araújo M，Pimentel F B，Alves R C，et al.Phenolic compounds from olive mill wastes：Health effects，analytical approach and application as food antioxidants［J］.Trends in Food Science&Technology，2015，45（2）：200-211.

［12］杨瑾，唐传核.鸡蛋清蛋白水解物的抗氧化性研究 ［J］.现代食品科技，2011，27（12）：1 446-1 450.

［13］Huang B，He J，Ban X，et al.Antioxidant activity of bovine and porcine meat treated with extracts from edible lotus（Nelumbo nucifera）rhizome knot and leaf［J］.Meat Science，2011，87（1）：46-53.

［14］Suhaj M，Rácová J，Polovka M，et al.Effect of γirradiation on antioxidant activity of black pepper（Piper nigrum L）. ［J］.Food Chemistry，2006，97（4）：696-704.

［15］李铮.草鱼主要过敏原小清蛋白亚型纯化鉴定及加工对过敏原影响的研究 ［D］.北京：中国农业大学，2014.

［16］Tong P，Gao J，Chen H，et al.Effect of heat treatment on the potential allergenicity and conformational structure of egg allergen ovotransferrin［J］.Food Chemistry，2012，131（2）：603-610.

［17］刘文营.高密度二氧化碳杀菌蛋白液贮藏期间微生物和理化功能性质变化 ［J］.食品研究与开发，2014，35（10）：119-123.

［18］Soyer A，Özalp B，Dalmˌs Ü， et al.Effects of freezing temperature and duration of frozen storage on lipid and protein oxidation in chicken meat［J］.Food Chemistry，2010，120（4）：1 025-1 030.

［19］Kanatt S R，Chander R，Sharma A.Antioxidant potential of mint（Mentha spicata L）. in radiation-processedlamb meat［J］.Food Chemistry，2007，100（2）：451-458.

［20］Sakanaka S，Tachibana Y.Active oxygen scavenging activity of egg-yolk protein hydrolysates and their effects on lipid oxidation in beef and tuna homogenates［J］.Food Chemistry，2006，95（2）：243-249.

［21］陈飞.鸡蛋气调包装贮藏技术研究 ［D］.北京：中国农业大学，2013.

［22］郝丽芳.鸡蛋贮藏期间蛋黄比较蛋白质组学研究 ［D］.武汉：华中农业大学，2014.

［23］吴序栎，杨志华，刘志刚，等.鸡蛋过敏原分离、鉴定与纯化 ［J］.中国公共卫生，2009，25（1）：127-128.

［24］毕井辉.不同处理方法对鸡蛋清中卵白蛋白抗原性的影响 ［D］.无锡：江南大学，2013.

［25］费国源，孙培龙.蛋白酶酸处理对小麦面筋蛋白溶解度和起泡性的影响 ［J］.农产品加工（学刊），2009（1）：32-34.◇

The Changes of Antioxidation Parameters and Antigenicity Characteristics of Ovalbumin in Refrigerated-Storage Liquid Whole Egg Samples During Irradiation Sterilization Treatments

DAI Yan1，HAN Zhaopeng1，FAN Bei2，LU Jia2，*LU Xiaoming1
（1.Beijing DQY Agricultural Technology Co.，Ltd.，Beijing 102115，China；2.Institute of Atomic Energy Use，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China）

In order to investigate the changes of antioxidant parameters and ovalbumin antigenicity characteristics of ovalbumin in whole liquid egg samples of control，pasteurization and irradiation sterilization（2，4，6 kGr） treatments during refrigerated storage at 4℃（0，10，20 days）for about 20 days，the antioxidant parameters include free sulfhydryl content，DPPH radical scavenging ability，hydroxyl radical scavenging ability and reducing powder.The samples of liquid whole egg under irradiation treatments（2，4，6 kGr）had significantly higher（p＜0.05）DPPH and hydroxyl radical scavenging ability than the control group at 10 days.No significant difference（p＞0.05） in free sulfhydryl contents is detected among whole liquid egg samples of control，pasteurization and irradiation 2 kGr sterilization groups.The results of SDS-PAGE and Western-blot show that irradiation sterilization treatments could not destroy the main antigenicity（ovalbumin）in whole liquid egg samples.

irradiation sterilization；DPPH radical scavenging ability；hydroxyl radical scavenging ability；antigenicity；whole liquid egg

TS201.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.01.001

2015-11-04

蛋制品加工技术研发与产业化示范（2012BAD28B08）；公益性行业（农业）科研专项（201303084）。

戴 妍（1986— ），女，博士，助理研究员，研究方向为蛋品科学与加工技术。

*通讯作者：卢晓明（1982— ），男，博士，高级研究员，研究方向为蛋品科学与加工技术。