高效液相色谱法测定新疆地区甜叶菊中甜菊苷和莱鲍迪苷A的含量

闫　莉，何巧丽，周晓英

(新疆医科大学中心实验室,乌鲁木齐　830011)



高效液相色谱法测定新疆地区甜叶菊中甜菊苷和莱鲍迪苷A的含量

闫莉，何巧丽，周晓英

(新疆医科大学中心实验室,乌鲁木齐830011)

目的建立测定新疆地区甜叶菊中甜菊苷和莱鲍迪苷A含量的方法。方法采用高效液相色谱法,色谱柱为Agilent·Zorbax·SB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-磷酸钠缓冲液(32∶68 v/v.pH=2.60)，流速为1.0 mL/min；检测波长为210 nm。结果甜菊苷和莱鲍迪苷A进样量分别在0.426～2.130 μg、1.816～5.448 μg范围内与峰面积积分分值呈良好线性关系(r=0.999 9)，二者精密度、稳定性、重复性试验的RSD≤1.50%，平均加样回收率分别为99.98%、100.06%，RSD分别为0.86%、1.16%，测得甜叶菊中甜菊苷的含量为5.74 mg/g，莱鲍迪苷A的含量为10.80 mg/g。结论高效液相色谱法简便、准确、重复性好，可用于新疆地区甜叶菊中甜菊苷和莱鲍迪苷A的含量测定。

甜叶菊；甜菊苷；莱鲍迪苷A；高效液相色谱法；含量测定

甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)又称甜菊，属菊科(Compositae)，斯台维亚属植物。甜叶菊原产于南美亚热带地区，我国于1977年引进栽培获得成功，在黑龙江、江苏、四川等地大面积种植，新疆由于气候条件独特，经过近几年的引进种植，发现所种植的甜叶菊糖度更高，品质更好。甜菊糖，又名甜菊糖苷，是一种高甜度、低热量的新型天然甜味剂，是甜叶菊中的有效成分，其甜度可达到蔗糖甜度的200～350倍，而热值只是蔗糖热值的1/300，是在甘蔗和甜菜糖之后第三种最具开发价值和健康推崇的天然糖源，被国际上誉为“世界第三蔗糖”[1]。由于甜菊糖热量低，在人体内不被吸收，日常食用不会影响人体血糖水平，已广泛应用于肥胖症、高血压、糖尿病患者的饮食中[2-3]。甜菊糖是一系列甜菊糖苷类的混合物，已从甜菊糖中分离出甜菊苷(St)、莱鲍迪苷A(RA)、莱鲍迪苷B(RB)、莱鲍迪苷C(RC)等8种不同甜味成分，其中甜菊苷和莱鲍迪苷A是甜菊糖的主要糖苷成分[4-5]。目前测定甜叶菊中甜菊糖的方法有质量法、碱量法、分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法等[6-7]。高效液相色谱法因分辨率高、速度快、重复性好，在含量测定中被广泛使用[8-11]，我国制定的GB 8270-1999标准是国内现有评价甜叶菊中甜菊糖的唯一标准，采用氨基色谱柱，以甜菊苷为标准品检测甜菊苷含量，以甜菊苷为标准品乘系数法得到莱鲍迪苷A的含量[12]。此法选用氨基色谱柱的使用寿命短且所测得莱鲍迪苷A含量不准确。本研究选用稳定性更好的C18色谱柱，分别以甜菊苷、莱鲍迪苷A为标准品，采用高效液相色谱方法检测新疆地区种植的甜叶菊中2种物质的含量，比国标法检测更加准确、简便,也为新疆地区甜叶菊的开发利用及其质量评价提供有效依据，现报道如下。

1　仪器与试药

1.1仪器Agilent1200高效液相色谱仪(DAD检测器，二元泵，美国Agilent公司),Agilent·Zorbax·SB-C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm，美国Agilent公司),Mettler Toledo电子分析天平(德国Mettler公司),AK-100摇摆式中药粉碎机(温岭市奥力中药机械有限公司),HH-S6水浴锅(金坛市医疗仪器厂)。

1.2试药甜叶菊采于新疆阜康，经新疆医科大学中医学院李永和主任药师鉴定为菊科甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)干燥的叶子,甜菊苷对照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批号：14102111),莱鲍迪苷A对照品(谱赛科生物技术有限公司，批号：20150203),色谱纯乙腈(美国Fisher公司)，实验用水为超纯水。

2　方法与结果

2.1溶液制备

2.1.1对照品溶液 精密称取甜菊苷对照品2.13 mg，加入适量的流动相进行溶解并定容至5 mL容量瓶中。精密称取莱鲍迪苷A对照品4.54 mg，加入适量的流动相进行溶解并定容至5 mL容量瓶中。分别制得浓度为0.426 mg/mL的甜菊苷对照品溶液和浓度为0.908 mg/mL的莱鲍迪苷A对照品溶液。

2.1.2供试品溶液称取本品粉末(过三号筛)2 g，加入10倍量70%乙醇，浸泡30 min，在80℃水浴里回流提取 1 h，将提取液离心，收集滤液，浓缩，蒸干，用流动相定容至50 mL容量瓶中，即得。

2.2色谱条件与系统适用性实验Agilent·Zorbax·SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-磷酸钠缓冲液(pH=2.60,32∶68 v/v),流速1.0 mL/min,检测波长210 nm；柱温为40℃；进样量：10 μL。以甜菊苷峰计算理论塔板数可达8 000以上，以莱鲍迪苷A峰计算理论塔板数可达6 000以上，两峰的分离度>1.5，样品中甜菊苷色谱峰和莱鲍迪苷A色谱峰与其他峰能够达到基线分离，见图1～3。

图1　莱鲍迪苷A对照品高效液相色谱图

图2　甜菊苷对照品高效液相色谱图

2.3线性关系考察分别精密吸取甜菊苷对照品溶液1、2、3、4、5 μL和莱鲍迪苷A对照品溶液2、3、4、5、6 μL，注入液相色谱仪中，按照“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以对照品进样量(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，见表1。

图3　供试品高效液相色谱图(1.莱鲍迪苷A；2.甜菊苷)

成分回归方程线性范围/μg相关系数甜菊糖苷Y=105.7X-6.3120.426～2.1300.9999莱鲍迪苷AY=179.4X-14.551.816～5.4480.9999

2.4精密度试验精确吸取甜菊苷对照品溶液、莱鲍迪苷A对照品溶液各10 μL，按照“2.2”项下色谱条件进样操作，连续进样6次，测定峰面积。结果甜菊苷和莱鲍迪苷A的RSD值分别为0.67%、1.01%(n均=6)，说明仪器的精密度良好。

2.5稳定性试验精密量取供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h按照“2.2”项下色谱条件进样10 μL，测定甜菊苷和莱鲍迪苷A的峰面积值，结果RSD值分别为1.12 %、1.32%(n均=6)，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6重复性试验称取同一批的甜叶菊样品粉末6份各2.0 g，按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件进样10 μL，测定甜菊苷和莱鲍迪苷A的峰面积，计算样品中甜菊苷和莱鲍迪苷A的含量。结果样品中甜菊苷的含量为5.65%，RSD为0.86%，莱鲍迪苷A的含量为10.7%，RSD为0.97%，说明该方法重复性良好。

2.7加样回收率试验精密称取已知甜菊苷和莱鲍迪苷A含量的同一批甜叶菊样品粉末1 g，共6份，分别精密加入适量的甜菊苷和莱鲍迪苷A对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按照“2.2”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算加样回收率，平均加样回收率分别为99.98%、100.06%,RSD分别为0.86%、1.16%,见表2。

表2　加样回收率试验结果(n=6)

2.8样品含量测定分别取采于新疆阜康的甜叶菊3批样品各约2 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按照上述色谱条件进样测定，记录峰面积，以外标法计算样品中甜菊苷的含量为5.74 mg/g，莱鲍迪苷A的含量为10.80 mg/g。

3　讨论

3.1提取条件的考察前期在供试品溶液制备时尝试了热水浸提法，发现该方法耗时长，能耗高，增加了后续分离纯化的难度。考虑到甜叶菊中甜菊苷和莱鲍迪苷A的溶解性问题，选用能耗低，操作简便快捷的回流提取法，对提取溶剂、提取时间进行了考察，发现选用70%乙醇提取1 h较完全，故选择该提取条件。

3.2检测波长的选择在200～600 nm波长范围内对对照片和样品的紫外吸收扫描。最终选择210 nm作为甜菊苷和莱鲍迪苷A的检测波长，样品干扰峰较少，待测组分分离效果良好。

3.3流动相的选择选择不同体积比的甲醇-水、乙腈-水、 乙腈-磷酸钠缓冲液等流动相系统进行预实验，发现采用乙腈-磷酸钠缓冲液(pH=2.60)，体积比为32∶68时，样品中甜菊苷和莱鲍迪苷A与其它峰分离较好，重现性高，故选其为流动相。

综上所述，本研究选用使用寿命更长、稳定性更好的C18色谱柱，分别以甜菊苷、莱鲍迪苷A为标准品，建立高效液相检测方法首次检测新疆地区种植的甜叶菊中2种物质，并进行了方法学考察。实验结果表明高效液相色谱法简单易行，稳定可靠，可用于新疆地区种植甜叶菊中甜菊苷和莱鲍迪苷A成分的含量测定。

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(本文编辑施洋)

Content determination of Stevioside and Rebaudioside-A in Stevia rebaudiana Bertoni in Xin Jiang province by HPLC

YAN Li,HE Qiaoli,ZHOU Xiaoying

(Central of Laboratory,Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China)

ObjectiveTo establish the method for the content determination of Stevioside and Rebaudioside A in Stevia rebaudiana Bertoni in Xin Jiang province.MethodsHPLC method was adopted.The determination was performed on Agilent·Zorbax·SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)column with mobile phase consisted of acetonitrile-Sodium phosphate (pH=2.60 32:68 v/v) at the flow rate of 1.0mL/min.The determination wavelength was set at 210nm.ResultsThe linear ranges of Stevioside and Rebaudioside-A were 0.426～2.130 μg,1.816～5.448 μg(r=0.999 9),respectively.RSDs of precision,stability and reproducibility tests were all lower than 1.50%.Average recovery were 99.98% (RSD=0.86%),100.06%(RSD=1.16%),respectively.The average measured content of stevioside was 5.74mg/g.The average measured content of Rebaudioside A was 10.8mg/g.ConclusionThe method is easy,accurate and reproducible,and can be used for the determination of Stevioside and Rebaudioside-A in Stevia rebaudiana Bertoni in Xin Jiang province.

Stevia rebaudiana Bertoni;Stevioside; Rebaudioside A; HPLC;Content determination

新疆医科大学科研创新基金(XYDCX201405)

闫莉(1988-)，女，硕士，研究实习员，研究方向：中药新剂型、新制剂研究。

周晓英，女，硕士，教授，硕士生导师，研究方向：中药化学，E-mail:597205931@qq.com。

R914

A

1009-5551(2016)11-1444-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.11.024

2015-10-18]