正交试验优化逆三相膜萃取烟碱的工艺研究

米尔扎提·麦麦提，尔西丁·买买提，喀日耶姆·艾海提，艾尔肯·依不拉音

(新疆医科大学1公共卫生学院；2药学院；3中心实验室，乌鲁木齐　830011)



·药学研究·

正交试验优化逆三相膜萃取烟碱的工艺研究

米尔扎提·麦麦提1，尔西丁·买买提1，喀日耶姆·艾海提2，艾尔肯·依不拉音3

(新疆医科大学1公共卫生学院；2药学院；3中心实验室，乌鲁木齐830011)

目的优化逆三相膜萃取烟叶中烟碱的提取工艺。方法采用聚四氟乙烯膜(PTFE)作为萃取膜,硫酸溶液作为酸相、氢氧化钠溶液作为碱相、氯仿作为有机相的逆三相膜萃取循环系统萃取烟碱叶中烟碱。依据烟碱在261 nm处有特征吸收，采用紫外分光光度计检测烟碱叶中游离烟碱的含量。以烟碱萃取率为指标,考察酸浓度、碱浓度、循环时间、酸碱水相及有机相体积比和流速5个因素,选定最佳工艺。结果提取烟叶中烟碱的最佳提取工艺条件为：酸浓度0.01%，碱浓度5%，循环时间25 min，体积比(酸碱相∶有机相)2.5∶1，流速6 mL/min，烟碱的提取率达到99.07%。对正交试验数据进行统计分析，差异有统计学意义(P<0.05)。按最佳工艺进行3次重复实验,结果显示烟碱提取率均值达到99.01%。结论该工艺操作简单，萃取时间快，有机溶剂的消耗量少，易实现工业化，环境污染少，适用于烟叶中烟碱的提取。

逆三相膜萃取；分光光度法；烟碱；正交设计

烟碱(俗称尼古丁)的化学名称为1-甲基-2(2-吡啶基)吡啶烷，属天然烟叶中含有的一种特殊生物碱。因烟碱化学性质不稳定，通常在工业生产上用稀硫酸吸收制成硫酸烟碱[1-2]。近年来,随着农业、化工、医药和烟草业等领域的迅速发展,市场上对天然烟碱的需求量与日俱增,因此从废弃烟草中提取烟碱具有很高的经济价值。从烟叶中提取烟碱的研究已受到学者的关注[3]。目前从烟叶中提取烟碱的常用方法有溶剂萃取法[4]、超临界萃取法[5]、水蒸气蒸馏法[6]、离子交换法[7]、超声辅助酶法[8]等。蒸馏萃取法是较早应用于工业化生产的提取方法。采用二次萃取蒸馏法可从废次烟叶中得到了纯度较高的烟碱，但该方法操作步骤复杂,萃取时间较长。离子交换法是将原料用稀酸浸提,加热回流后,使滤液流经离子交换树脂,然后用碱交换得到游离烟碱的水溶液。该方法虽耗能较低,但仍存在离子交换树脂的预处理及再生较为繁琐的缺点。采用超临界CO2萃取法萃取烟叶中的烟碱,可获得较好的提取效率,但是该方法的设备成本较高,不利于普及和推广。本研究在单因素试验的基础上通过正交设计优化了逆三相膜萃取烟叶中烟碱的提取工艺，现报道如下。

1　仪器与试剂

1.1仪器紫外分光光度计(日本岛津，UV-2550)，JJ-1增力电动搅拌器(金坛市医疗机械厂)，水泵(日本岛津PRR-2A)，聚四氟乙烯膜(镇江瑞思高分子材料有限公司),125 mL分液漏斗，250 mL三颈瓶。

1.2试剂氢氧化钠(天津永晟精细化工有限公司GB/T646-2011)，硫酸(西安化学试剂厂)，氯仿(天津市富鑫商贸有限公司)，尼古丁标准品(Augsburg Germany)浓度为0.005 mg/mL，其他试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。

2　方法与结果

2.1烟碱的萃取方法取2个250 mL的三颈瓶分别标记为A和B。在B瓶中加入100 mL的硫酸溶液(0.01 mol/L)和40 mL氯仿。在A瓶中加入0.005 mg/mL的烟碱溶液1 mL和5%氢氧化钠溶液100 mL，搅拌5 min,使充分混匀，再在A瓶中加入40 mL氯仿。将分离膜装置插入到A和B 2个三颈瓶中(250 mL)。2个瓶中溶液同时开始搅拌并启动循环泵循环有机相(氯仿6 mL/min)，萃取一定时间后，A瓶中的烟碱会从A瓶中的碱性水相萃取到有机相，有机相通过分离膜和循环泵转移到三颈瓶B中。在搅拌的B瓶中，有机相中的烟碱转移至酸性水相。循环25 min后，A瓶中烟碱绝大部分会转移至B瓶中，最终将烟碱几乎完全萃取到酸性水相中，见图1。

A：碱性水相；B：酸性水相；S：PTFE膜；M：搅拌器；P：循环泵

图1逆三相膜萃取系统装置图

2.2检测波长的选择以氢氧化钠溶液为空白溶剂，对尼古丁标准溶液进行紫外-可见光谱扫描，烟碱在261 nm处有最大吸收，因此将261 nm作为测定烟碱含量的检测波长。

2.3烟碱标准曲线的绘制分别称取烟碱标准品0.625、1.250、1.875、2.500、3.125、3.750、4.375 mL于25 mL棕色容量瓶中，加入0.01 mol/L硫酸溶液定容至25 mL，超声3 min，配置成0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035 mg/mL标准溶液，在261 nm处测定吸光度。以烟碱浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线,回归方程:Y=17.923X+ 0.010 7，线性范围:5～35 μg/mL，r=0.999 1。

2.4单因素试验以烟碱叶中烟碱萃取率为衡量指标，分别考察碱浓度、循环时间、酸浓度、体积比(酸碱相∶有机相)和流速5个因素。初步确定烟碱萃取的适宜水平范围：酸浓度0.01%，循环时间25 min，体积比(酸碱相∶有机相)2.5∶1，流速6 mL/min时，碱浓度5%。

2.5正交试验设计

2.5.1影响因素与水平[9-11]根据单因素(A酸浓度、B碱浓度、C循环时间、D体积比、E流速)试验结果，确定正交实验需考察各影响因素的水平。采用L16(45)正交试验,对逆三相膜提取工艺初步进行优选，见表1。

表1　L16(45) 正交试验因素水平表(n=3)

2.6单因素试验

2.6.1碱浓度对烟碱萃取率的影响考虑碱浓度对萃取烟碱效果的影响时，在酸浓度至0.01%、循环时间25 min、体积比(酸碱相∶有机相)2.5∶1、流速为 6 mL/min时，在碱浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%及9%进行试验。相应的烟碱提取率为13.10%、16.70%、 28.01%、40.87%、61.03%、54.82%、48.70%、18.01 %。可以看出碱浓度在5 %时效果最好。

2.6.2循环时间对烟碱萃取率的影响当碱浓度5%、酸浓度0.01%、体积比(酸碱相：有机相)2.5∶1、流速为6 mL/min时，在本试验条件下分别以不同时间(5、10、15、20、25、30、35、40 min)的萃取时间进行试验。相应的烟碱提取率为13.01%、24.03%、51.76%、83.34%、94.47%、95.56%、96.01%、97.34%。随着处理时间的延长，烟碱萃取率逐渐增大，25 min后，萃取率变化不明显，故选取25 min为合适的萃取时间。

2.6.3酸浓度对烟碱萃取率的影响以不同酸浓度(0.0025、0.005、0.01、0.015、0.02、0.025%) 进行试验，在碱浓度5%、循环时间25 min、体积比(酸碱相∶有机相)2.5∶1、流速为6 mL/min时，相应的烟碱提取率为47.53%、63.00%、81.76%、72.00%、64.21%、51.00%。当酸浓度0.01%时,烟碱的萃取率达到最高．所以选取0.01%酸浓度为最佳的萃取浓度。

2.6.4体积比(酸碱相∶有机相)对烟碱萃取率的影响以不同体积比(0.5∶1、1∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1) 进行试验，在碱浓度5%、酸浓度0.01%、循环时间25 min、流速为6 mL/min时，相应的烟碱提取率为30.34%、35.50%、41.43%、47.75%、37.00%、26.49%。体积比在0.5∶1～2.5∶1范围内，烟碱烟叶的萃取率随萃取剂用量的增大而增加，当体积比为2.5∶1时烟碱的萃取率达最高值，之后再增大萃取剂用量，萃取率有下降。这是由于体积比为2.5∶1时，烟碱的溶解已基本达饱和，故体积比控制在2.5∶1为最宜。

2.6.5流速对烟碱萃取率的影响当碱浓度5%、酸浓度0.01%、体积比(酸碱相:有机相)2.5∶1，循环时间25 min时，在本试验条件下分别以不同流速(1.5、3、4.5、6、7.5 mL/min)进行试验，随着烟碱萃取流速的提高，烟碱的萃取率先明显增大。相应的烟碱提取率为26.70%、51.09%、82.90%、99.27%、83.00%。在6 mL/min时萃取率达最佳值，之后烟碱萃取率开始下降。这可能是因为适度升速有利于烟碱的扩散和浸出，萃取率增加，但流速过高烟碱结构可能会被破坏，萃取率下降。因此，选择烟碱萃取流速6 mL/min适宜。

2.7正交试验各因素对提取率的影响顺序为:A>E>B>C>D,即酸浓度>流速>碱浓度>循环时间>体积比,其中最佳提取工艺条件为A3B4C2D1E3,即酸浓度0.01%、碱浓度5 %、循环时间25 min、体积比2.5∶1、流速6 mL/min。结果显示,在最佳工艺条件下提取物中烟碱提取率均高于其他各试验组合,烟碱平均提取率为99.07%,见表2。

表2　L16(45) 正交试验结果与分析表

F值的显著性概率(Sig.)为0.000,<0.05为达到显著性水平,说明烟碱提取量和各因素之间存在极显著的关系。由方差分析可知，对烟碱提取率影响最显著者为因素A，其次为因素E，再次为因素B、因素C、因素D。综合直观分析和方差分析,烟碱最佳提取工艺组合为A3B4C2D1E3,即酸浓度0.01%、碱浓度5%、循环时间25 min、体积比(酸碱相和有机相)2.5∶1、流速6 mL/min，见表3。

表3　方差分析表

2.8重复性试验按最优组合条件重复进行3次实验,烟碱的提取率分别为99.27%、99.07%、98.69%，平均提取率为99.01%,表明该方法具有良好的提取效果和重现性。

3　讨论

逆三相液膜萃取处理法进行提取,得到的提取液直接进行紫外-可见分光光度法测定含量,计算萃取率。这种提取方法有提高萃取率、减少萃取时间、有机溶剂可以重复使用、环境污染极少等优点。烟碱属于吡啶类生物碱[12-13]，易与无机酸和多种有机酸结合，分离出游离态的烟碱，根据游离态烟碱在不同溶剂中溶解状态和性质存在差异对烟碱进行萃取。本研究运用正交试验设计法，采用L16(45)正交表进行烟碱萃取试验条件优化，确定烟碱萃取的最佳工艺。逆三相液膜萃取法提取烟碱，方法简便，操作简单，对烟碱的提取开发利用具有重要的意义。

[1]李晓芹，杜咏梅，张怀宝，等.烟草绿原酸、芸香苷、烟碱和茄尼醇的提取技术研究[J].中国烟草科学，2015，36(1)：1-4.

[2]梁金锋，李玉文.烟草生物碱的提取[J].内蒙古科技与经济，2012,18(10)：83-86.

[3]尹斯雅，王颉，王敏，等.不同处理条件对烟草烟碱提取量的影响[J].中国农学通报，2008，24(11)：150-155.

[4]Lian CG.Nicotine concentration process research[J].Electronic Test,2015(11):167-168.

[5]瞿先中，王宏伟，程雷平，等.超临界萃取烟草精油条件的优化[J].安徽农业科，2010，38(35)：20448-20450.

[6]常艳红，施小宁.超声辅助萃取改进水蒸气蒸馏法提取废次烟叶中烟碱[J].陇东学院学报，2011，22(2)：46-47.

[7]Ming NN,Guo JC,Liu Q.Extraction and analysis of alkaloids in tobacco:a review[J].Acta Tabacaria Sinica,2007,31(3):64-70.

[8]朱松，娄在祥，陈尚卫，等.超声辅助酶法提取废次烟叶中绿原酸、烟碱工艺研究[J].食品工业科技，2012，33(5)：181-183.

[9]马俊勃.烟碱提取的研究进展[J].广东化工，2011，38(10)：72-73.

[10]李超，史宏志，刘国顺，等.烟草烟碱转化及生物碱优化研究进展[J].河南农业科学，2007，36(6)：14-17.

[11]Huang F,Qu FQ,Li CJ.Optimization of nicotine extraction with microwave-assisted method from discarded tobacco leaves by orthogonal experiment[J].J Human Agricultural University,2015,41(2):132-135.

[12]Jiang WG.Study on optimum process for semi-bionic extraction of nicotine from abandoned white burley tobacco leaves by orthogonal test [J].J Math Med,2012,25(6):672-675.

[13]张朋，杨玉良，耿哲，等.烟叶中烟碱的微波提取[J].山西大同大学学报，2015，31(4)：41-43.

(本文编辑施洋)

Research on optimization reverse phase membrane extraction of nicotine with orthogonal method

Mirzat Maimaiti1，Erxiding Maimaiti1，Kariyemu Aihaiti2，Arkin Iburaim3

(1College of Pubilic Health；2College of Pharmacy；3Central Laboratory，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011,China)

ObjectiveTo optimize extraction process of nicotine from tobacco leaves by reverse phase membrane.MethodsUsing PTFE membrane as extraction membrane,sulfuric acid solution as acid,sodium hydroxide solution as the alkali phase,chloroform as organic phase,the extraction of nicotine from nicotine leaves was carried out by reverse phase membrane extraction and circulation system.According to the characteristics of nicotine on 261 nm UV absorption,UV spectrophotometer was used to determine free nicotine content in nicotine leaves.The orthogonal design optimization of 5 factors and 4 levels L16(45) was investigated,nicotine extraction rate as the index,inspection concentration of acid,alkali concentration,cycle time,acid and alkali phase and organic phase volume ratio and flow rate on the influence of the nicotine extraction.ResultsThe best extraction conditions of extracting nicotine in tobacco leaf are acid concentration 0.01%,alkali concentration 5%,cycle time 25 min,volume ratio (acid-base phase:organic phase) 2.5∶1,the velocity 6 mL/min.The nicotine extraction rate reached 99.07%.Orthogonal test data statistical analysis expressed (P<0.05),which has significant differences.Repeated experiments were carried out three times under the best extraction conditions.The optimal combination of repetitive experimental results showed that the average nicotine extraction rate reached 99.01%.ConclusionThe process is simple,and extraction time is short,and consumption of organic solvent is low.It is easy to realize industrialization with less pollution and suitable for the extraction of nicotine from tobacco.

Reverse phase membrane extraction; Spectrophotometric method; nicotine; orthogonal design; extract

国家自然科学基金(21162030)

米尔扎提·麦麦提(1989-)，男(维吾尔族)，在读硕士，研究方向：统计学。

尔西丁·买买提，男(维吾尔族)，博士，教授，硕士生导师，研究方向：卫生统计，E-mail:624799002@qq.com。

通信作者：艾尔肯·依不拉音，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：药物分析，E-mail:arkinxyd@sina.com。

R94

A

1009-5551(2016)11-1436-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.11.022

2016-06-12]