高效液相色谱法同时测定工夫红茶中10 种内含物成分

刘洪林，童华荣*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆第二师范学院旅游与服务管理系，重庆 400065）

高效液相色谱法同时测定工夫红茶中10 种内含物成分

刘洪林1，2，童华荣1，*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆第二师范学院旅游与服务管理系，重庆 400065）

建立高效液相色谱法同时测定工夫红茶中咖啡碱、儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3’-没食子酸酯、茶黄素双没食子酸酯10 种内含物成分含量的方法。通过色谱条件优化，确定出工夫红茶中10 种内含物成分含量测定的最佳色谱条件为：色谱柱为Whatman Partisphere C18液相色谱柱（4.6 mm×125 mm，5 μm）、柱温32 ℃、流动相为0.035%三氟乙酸-5%乙腈溶液和0.025%三氟乙酸-50%乙腈溶液、流速1 mL/min、进量量10 μL、检测波长205 nm。在此条件下，上述10 种内含物成分得到很好的分离和测定。各种内含物的线性范围为0.05～500 μg/mL，标准曲线相关系数均在0.999 8以上，精密度检测相对标准偏差为0.72%～3.32%（n=5），重复性检测相对标准偏差为1.87%～4.43%（n=5），回收率在94.73%～102.38%之间。该方法简单、快捷、准确、重复性好，可应用于工夫红茶中10 种内含物质的同时快速测定。

工夫红茶；高效液相色谱法；内含物；测定

刘洪林， 童华荣. 高效液相色谱法同时测定工夫红茶中10 种内含物成分［J］. 食品科学， 2016， 37（8）: 97-101.

工夫红茶是一种全发酵茶类，经萎凋、揉捻、发酵、干燥一系列工艺加工而成［1］。工夫红茶是我国特有的红茶品种，富含茶多酚、氨基酸、咖啡碱、儿茶素（catechin，C）、茶黄素（theaflavin，TF1）等多种内含营养成分［2］，因此具有抗氧化［3］、抗癌［4］、降血压［5］、降血糖［6］、降血脂［7］等保健功能而深受人们喜爱。我国的工夫红茶主要有祁红工夫［8］、川红工夫［9］、滇红工夫［10］、闽红工夫［11］、湖红工夫［12］、宁红工夫［13］、宜红工夫［14］等，国外主要有印度的大吉岭红茶［15］和阿萨姆红茶［16］、斯里兰卡的乌沃茶［17］知名。

内含物质的测定方法常有分光光度法、气相色谱法、比色法等［18-20］，然而这些方法都存在步骤多、时间长、精密度差、准确度低等的局限性。近年来，高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法因其分离效率高、准确度和精密度好等优点被越来越多地用于快速检测领域。目前，国内外采用HPLC法在同一液相色谱条件下对茶叶的研究主要集中在黄酮类物质成分［21］，黄烷醇、3-邻-没食子酰奎尼酸、没食子酸以及咖啡碱成分［22］，儿茶素、咖啡碱和没食子酸成分［23］，草甘膦、氨甲基膦酸及草铵膦成分［24］等方面，而在同一液相条件下测定咖啡碱、C、表儿茶素（epicatechin，EC）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、TF1、茶黄素-3-没食子酸酯（theaflavin-3-gallate，TF2A）、茶黄素-3’-没食子酸酯（theaflavin-3’-gallate，TF2B）、茶黄素双没食子酸酯（theaflavin-3，3’-digallate，TF3）10 种内含物质成分含量还鲜有研究。因此，本实验量建立HPLC同时测定工夫红茶中咖啡碱10 种内含物成分的分析方法，并对含量进行测定，以期为茶叶品质成分分析提供有益参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

滇红 云南滇红集团股份有限公司；川红 四川宜宾川红茶叶集团有限公司；祁红 安徽国润茶叶有限公司；斯里兰卡工夫红茶 斯里兰卡Mackwoods茶庄。

C、EC、EGC、ECG、EGCG、咖啡碱、TF1、TF2A、TF2B、TF3标准品、乙腈、甲醇、三氟乙酸（均为色谱纯） 美国Sigma公司；乙酸乙酯、正丁醇、碳酸氢钠、草酸（均为分析纯） 重庆博艺化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

HH-8型数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；C18高效液相色谱仪 美国Agilent公司；Partisphere C18液相色谱柱（4.6 mm×125 mm，5 μm） 美国Whatman公司；DFT-200型200 g手提式粉碎机 温岭市林大机械有限公司；FA2004A型分析天平 海津天电子仪器有限公司；Mili-Q超纯水仪 美国密理博公司；Centrifuge5810高速离心机 德国Eppendorf公司。

1.3方法

1.3.1色谱条件

Whatman Partisphere C18色谱柱（4.6 mm×125 mm，5 μm）；检测器：二极管阵列检测，器柱温32℃，流动相A相为0.035%三氟乙酸-5%乙腈（V/V）溶液、B相为0.025%三氟乙酸-50%乙腈（V/V）溶液，梯度洗脱，30 min内完成，梯度洗脱程序见表1，流速1 mL/min，进量量为10 μL，检测波长为205 nm。

表1　HPLC洗脱梯度Table 1 Elution gradient program for HPLC separation

1.3.2量品处理

准确称取每个茶量0.5 g，分别粉碎后转入100 mL棕色锥形瓶中，加入50 mL沸超纯水，于90 ℃水浴锅中恒温水浴30 min，期间顺时针摇动30 s，使内含物质充分浸出。冷却后将上清液充分过滤到100 mL棕色离心管中，加入2 mL体积分数20%乙腈溶液，在15 000×g条件下离心2 min。待测液用0.22 μm滤膜过滤，将滤液置于2 mL的棕色进量瓶中待色谱测定。

1.3.3标准曲线绘制

分别精密称取C、EC、EGC、ECG、EGCG、咖啡碱、TF1、TF2A、TF2B、TF3标准品各20 mg，用乙醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，摇匀，得2 mg/mL的混合内含物质标准母液。分别吸取各标准混合母液，用乙醇稀释至500、50、5、0.5、0.05 μg/mL系列混合标准溶液。将系列混合标准溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤至2 mL进量瓶中，进量，以质量浓度（X）对峰面积（Y），求回归方程和相关系数。

1.3.4量品测定

将处理后的量品提取液进行HPLC分析，进量量为10 μL。

1.4数据处理

各实验至少重复3 次以上，使用DPS7.05、Excel等软件进行图表的绘制和相关数据的处理。

2　结果与分析

2.1色谱条件的优化

2.1.1流动相的选择

设置流动相A相中酸体积分数0.035%、B相中酸体积分数0.025%，流速1 mL/min，柱温32 ℃，流动相以乙腈-水（A相0∶100、2∶98、5∶95、8∶92、10∶90，V/V）溶液；B相（40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40，V/V）不同比例相互搭配测定10 种内含物混合标准品和工夫红茶茶量提取液中各内含物成分含量和分离情况。结果表明两流动相中水的比例升高可以加快分离过程，但也会造成TF1、TF2A、TF2B、TF3色谱峰的相互重叠；而随着乙腈所占体积比例增加，内含物质分离程度提高，当乙腈-水体积比例A相为10∶90，B相为60∶40时，分离时间最佳，但保留时间太长。当流动相中乙腈-水体积比例A相为5∶95，B相为50∶50时分离效果也很好，相邻峰的分离度很好，且保留时间较短，10 种内含物30 min内出峰完毕。因此，在兼顾分离速度和分离效果的基础上，本实验采用流动相为乙腈-水体积比例为A相5∶95，B相50∶50。

2.1.2流动相酸体积分数选择

参照Lee等［25］方法，本实验选择三氟乙酸调节酸体积分数。设置流速1 mL/min，柱温32 ℃，以流动相A相体积分数5%乙腈溶液、B相体积分数50%乙腈溶液为流动相，用三氟乙酸调节酸体积分数，考察不同酸体积分数（A相0.030%、0.032%、0.035%、0.038%、0.040%；B相0.020%、0.022%、0.025%、0.028%、0.030%）10 种内含物质分离情况。结果发现，流动相A相和B相三氟乙酸体积分数相互搭配，三氟乙酸体积分数越低，10 种内含物质出峰时间缩短，但分离效果越差，出现多峰重叠现象；随着三氟乙酸体积分数升高，分离效果越好，然而出峰时间较长，且三氟乙酸体积分数过高易对色谱柱造成影响。综合考虑，当三氟乙酸体积分数流动相A 0.035%、B相0.025%时，分离效果好，且出峰时间适中，达到定量要求。该实验结果与Lee等［25］电泳法-HPLC法测定茶叶中内含物质最佳优化条件吻合。

2.1.3流速的选择

设置柱温32 ℃，以流动相A相为0.035%三氟乙酸-5%乙腈溶液、B相为含0.025%三氟乙酸-50%乙腈溶液为流动相，考察流速分别为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min时的分离情况，结果得知，流速越低，分析时间越长，分离结果影响不显著；随着流速升高，分析时间缩短，但分离程度逐渐变差，咖啡碱与C，TF1与TF2A、TF2B、TF3出现峰重叠现象，柱压升高。综合考虑分析时间、效果和柱压因素，最终确定1 mL/min的流速进行实验，此时分离结果最佳。

2.1.4柱温的选择

以流动相A相为0.035%三氟乙酸-5%乙腈溶液、B相为0.025%三氟乙酸-50%乙腈溶液为流动相，1 mL/min为流速不变，在20、24、28、32、36 ℃ 5 个柱温条件下分别进行测定。结果发现，柱温对工夫红茶10 种内含物分离结果影响较大，随着温度升高，随着柱温升高，各内含物出峰时间均提前，分离程度也越来越高，但到达36 ℃时，C、咖啡碱2 种物质的出峰面积增大。因此综合考虑，选择柱温32 ℃，分离效果最好。

2.2线性范围

将质量浓度在0.05～500 μg/mL范围内的一系列混标溶液进行HPLC分析，对测得各值进行相关系数分析和线性回归分析，结果见表2。图1为标量HPLC图。

表2　10 种内含物测定的线性相关性Table 2 Linear equations for determination of 10 of components

图1　混标溶液HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standards

由表1可知，除了C和EC的相关系数为0.999 8外，其他8 种内含物质的相关系数均为0.999 9，说明10 种内含物质组分的峰面积和组分质量浓度的线性相关性好，以此条件可以很好地测定10 种内含物的含量。

2.3精密度考察

将5 μg/mL的混标连续进量5 次，根据所得峰面积分别计算精密度，结果见表3。

表3　方法的精密度实验结果（n=5）Table 3 Results of precision experiments （n= 5）

由表3可知，10 种内含物质C、EC、EGC、ECG、EGCG、咖啡碱、TF1、TF2A、TF2B、TF3的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）范围在0.72%～3.32%之间，均小于5%，表明该方法精密度良好。

2.4重复性考察

精密称取同一工夫红茶量品5 份（川红），按1.3.2节方法制备供试品提取溶液，按上述色谱条件进量10 μL，结果见表4。

表4　方法的重复性实验结果（n=5）Table 4 Results of repeatability experiments （n= 5）

由表4可知，测得咖啡碱、C、EC、EGC、ECG、EGCG、TF1、TF2A、TF2B、TF3的平均含量为21.75、2.52、2.23、5.84、4.46、2.81、0.86、0.73、2.07、0.10 mg/g，RSD分别为3.78%、3.01%、3.77%、1.87%、3.81%、3.26%、4.43%、3.17%、4.39%、3.10%，均在5%以内，表明该方法的重复性均达到分析的要求。

2.5回收率考察

精确称取磨碎的工夫红茶茶量1 g，按1.3.2节方法制备量品提取液，准备同一量品提取液6 份（咖啡碱、C、EC、EGC、ECG、EGCG、TF1、TF2A、TF2B、TF3的质量浓度分别为0.435 0、0.050 5、0.044 6、0.116 9、0.089 2、0.056 3、0.017 2、0.014 5、0.041 4、0.002 1 mg/mL），将不同质量浓度的各种内含物质标量加入至每份提取液中，充分混匀后，使10 种内含物添加的质量浓度分别为0.500、0.100、0.100、0.200、0.200、0.100、0.050、0.050、0.050、0.005 mg/mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤后进量检测，平行测定6 次，根据加入的标准量品质量浓度和检出的质量浓度计算回收率，结果见表5。

由表5可知，10 种工夫红茶内含物组分的回收率为94.73%～102.38%，各种内含物RSD为0.98%～3.58%，均符合分析方法的要求。

表5　10 种内含物质测定的回收率实验（n=6）Table 5 Recovery rates of 10 components in spiked samples （n= 6）

2.6工夫红茶量品测定结果

按照1.3.2节方法制备量品提取液，依优化的色谱条件下进行分析，测定滇红、川红、祁红和斯里兰卡红茶（HYSON）10 种内含物成分含量，结果见表6，量品色谱图见图2。

表6　工夫红茶中10 种内含物质组分含量（n=6）Table 6 Contents of 10 components in Congou black tea （n= 6）mg/g

图2　工夫红茶样品色谱图Fig.2 Chromatogram of Congou tea sample

由表6可知，各种工夫红茶组分中咖啡碱含量是所有组分中最高，TF3含量最低。斯里兰卡红茶中各组分含量在所有茶类中均最高，咖啡碱、C、EC、EGC、ECG、EGCG、TF1、TF2A、TF2B、TF3含量依次为23.61、4.18、2.58、13.83、9.01、5.78、2.40、2.11、5.20、0.16 mg/g。其余3 个红茶品种中，咖啡碱、EC、EGC、TF2B含量：川红＞滇红＞祁红；C含量：滇红＞川红＞祁红；ECG、TF1、TF2A含量：祁红＞川红＞滇红；EGCG、TF3含量：川红＞祁红＞滇红，其中滇红的TF3未检测出。这一结果表明，在本实验建立的HPLC方法下，能准确检测出工夫红茶的10 种内含物。且本实验建立的HPLC方法具有能同时测定工夫红茶量品中10 种内含物、测定时间短等优点，是一种能够运用于茶叶中内含物质测定的快速检测方法。

3　结 论

本实验建立了一种快速、简便、准确、重复性好等优点的测定工夫红茶中咖啡碱、C、EC、EGC、ECG、EGCG、TF1、TF2A、TF2B、TF3 10 种内含物成分的方法——HPLC法。利用Whatman Partisphere C18液相色谱柱（4.6 mm×125 mm，5 μm），通过色谱条件的优化，流动相A相为0.035%三氟乙酸-5%乙腈溶液、B相为0.025%三氟乙酸-50%乙腈溶液，流速1 mL/min，柱温32 ℃，检测波长为205 nm，并经过精密度、重复性、回收率等方法的考察，在30 min内成功分离和定量分析了工夫红茶中10 种内含物成分。应用此方法成功测定出了滇红、川红、祁红和斯里兰卡工夫红茶品种中10 种内含物成分含量，为茶叶内含物成分分析提供有益参考。

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Determination of Ten Components in Congou Black Tea by HPLC

LIU Honglin1，2， TONG Huarong1，*
（1. College of Food Science， Southwest University， Chongqing 400715， China；2. Department of Tourism and Service Management， Chongqing University of Education， Chongqing 400065， China）

A high performance liquid chromatographic （HPLC） method was established for the simultaneous determination of ten components including caffeine， catechin （C）， epicatechin （EC）， epigallocatechin （EGC）， epicatechin gallate （ECG），epigallocatechin gallate （EGCG）， theaflavin （TF1）， theaflavin-3-gallate （TF2A）， theaflavin-3’-gallate （TF2B）， theaflavin-3，3’-digallate （TF3）， in Congou black tea. The chromatographic conditions were optimized. A Whatman Partisphere C18column （4.6 mm × 125 mm， 5 μm） was used to separate the ten compounds. The mobile phase was a mixture of 0.035% trifluoroacetic acid containing 5% acetonitrile （A） and 50% acetonitrile solution containing 0.025% trifluoroacetic acid and methanol solution （B） at a flow rate of 1 mL/min. The column temperature and UV detection wavelength were set as 32 ℃and 205 nm， respectively. The ten components were successfully separated and detected under the chosen experimental conditions. The calibration curves for all these components displayed a good linear relationship with correlation coefficients above 0.999 8 and precision relative standard deviations （RSDs） of 0.72%-3.32% （n = 5） and repeatability RSD of 1.87%-4.43% （n = 5）. The recovery rates of the ten compounds were in the range of 94.73%-102.38%. The method is convenient，rapid， accurate， reproducible and applicable to simultaneously determine these ten components in Congou black tea.

Congou black tea； high performance liquid chromatographic （HPLC）； components； determination

10.7506/spkx1002-6630-201608017

TS207.3

A

1002-6630（2016）08-0097-05

10.7506/spkx1002-6630-201608017. http://www.spkx.net.cn LIU Honglin， TONG Huarong. Determination of ten components in Congou black tea by HPLC［J］. Food Science， 2016，37（8）: 97-101. （in Chinese with English abstract）

10.7506/spkx1002-6630-201608017. http://www.spkx.net.cn

2015-09-01

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAF07B05-4）

刘洪林（1991—），男，助教，硕士，研究方向为茶学。E-mail：475844900@qq.com

童华荣（1963—），男，教授，博士，研究方向为茶学。E-mail：491214217@qq.com

引文格式：