热补针法对类风湿关节炎家兔关节滑膜LDH、SDH和CCO活性的影响

杜小正,王金海,秦晓光,方晓丽,张小江



热补针法对类风湿关节炎家兔关节滑膜LDH、SDH和CCO活性的影响

杜小正1,王金海2,秦晓光1,方晓丽1,张小江1

(1.甘肃中医药大学,兰州730000;2.兰州大学第二医院,兰州730000)

目的 观察热补针法对类风湿关节炎(RA)机体能量代谢酶的调节作用,初步解析热补针法“取热”的作用机制。方法 将40只青紫蓝家兔随机分为正常组、模型组、平补平泻组、捻转补法组和热补针法组。除正常组外,采用卵蛋白诱导法和低温冷冻法对其他4组家兔进行RA寒证模型复制。造模成功后第2天,正常组和模型组与其他针刺组相同方法抓取与固定(捆绑)1次/d,30 min/次。平补平泻组施以平补平泻法,捻转补法组施以捻转补法,热补针法组施以热补法,每次操作1 min,留针30 min/次,1次/d,共7 d。观察治疗前后RA家兔膝关节周径和关节滑膜组织病理切片炎症积分的变化;干预结束后处死家兔,快速分离关节滑膜,冰冻切片,借助组织化学染色技术观察膝关节滑膜组织乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)和细胞色素氧化酶(CCO)活性改变。结果 针刺干预后,平补平泻组、捻转补法组、热补针法组都能减少RA家兔膝关节周径,但热补针法组对减少RA家兔的膝关节周径作用优于平补平泻组和捻转补法组(＜0.05);热补针法组对减少RA家兔的关节滑膜组织病理切片炎症积分方面,也优于平补平泻组和捻转补法组。模型组滑膜LDH积分光度、阳性总面积、面积百分比显著高于正常组(＜0.05);平补平泻组、捻转补法组和热补针法组滑膜LDH积分光度、阳性总面积、面积百分比均显著低于模型组(＜0.05);热补针法组LDH积分光度、阳性总面积、面积百分比均显著低于平补平泻组和捻转补法组(＜0.05)。与正常组比较,模型组家兔关节滑膜SDH、CCO活性显著增高(＜0.05)。平补平泻组、捻转补法组和热补针法组家兔滑膜SDH和CCO积分光度、阳性总面积、面积百分比均显著高于模型组(＜0.05);热补针法组SDH和CCO积分光度、阳性总面积、面积百分比显著高于平补平泻组和捻转补法组(＜0.05)。结论 热补针法治疗RA疗效确切,可增强RA模型家兔SDH、CCO活性,从而增强有氧代谢,使机体局部产生更多的能量,这可能是热补针法“取热”的可能机制之一。

针刺补法;关节炎,类风湿;乳酸脱氢酶;琥珀酸脱氢酶;细胞色素氧化酶

《针灸大成·三衢杨氏补泻》:“烧山火,能除寒,三进一退热涌涌……”“进火针,初进一分……退三退,进三进……自然热矣。”说明这两种复式针刺手法不仅能够补益正气,而且可以产生热感。热补针法是郑毓琳、郑魁山简化烧山火手法和进火补法所形成的一种复式针刺手法,操作相对简便,具有温阳散寒的作用,临床证实能使患者局部产生热感[1]。课题组前期的研究[2-5]表明热补针法对类风湿关节炎(RA)模型家兔的镇痛效应优于临床常用的平补平泻法,证实了热补针法对RA具有治疗作用,并且证实与脑脊液中b-EP、CCK-8和关节局部组织中b-EP、PGE2和LEK的变化有关。但是,这些研究均是从疾病疼痛和镇痛相关的某些微观指标这一层面阐释了其机理,而未能体现热补针法作为“取热”手法的作用特点,尚缺乏其对机体能量代谢调节的分析研究,所以,还不足以揭示热补针法对RA的作用机制。

因此,本实验选择RA寒证模型家兔为研究对象,观察热补针法、捻转补法和平补平泻法三种针刺手法对能量代谢相关酶乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)和细胞色素氧化酶(CCO)的影响,分析比较这三种手法的作用差异,初步解析热补针法对RA家兔能量代谢的调节作用,揭示热补针法“取热”的作用机理。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

健康2.5月龄普通级雄性青紫蓝家兔40只,购于兰州生物制品研究所,动物合格证号SCXK(甘)2012- 0001,体重(2.5±0.5)kg,动物购回后在兰州军区总医院实验动物中心(许可证号SYXK2007-007)饲养,饲养环境温度(20±2)℃,相对湿度(50±10)%,按昼夜节律自然照明,自由进食和饮水(自来水),每星期称量1次体重。适应性饲养7 d后随机分为正常组、模型组、平补平泻组、捻转补法组和热补针法组,每组8只。

1.2 主要实验药品、试剂和仪器

弗氏完全佐剂(Sigma公司生产,批号120428)、卵蛋白干粉(上海伯奥生物科技有限公司,批号120513)、硫化钠(上海化学试剂二厂,批号120511)、华佗牌针灸针(苏州医疗用品厂有限公司,规格为0.25 mm×40 mm),LDH、SDH和CCO染色试剂盒(上海榕柏生物技术有限公司,批号20120569)、HANGPINGJAZO03精密天平(上海精密仪器公司)、Tissue-Tek TEC全自动组织包埋机(日本)、CM1900冰冻切片机(德国)、OLYMPUS 51TR-32FB3-E01光学显微镜(日本)。

1.3 造模方法

以卵蛋白诱导的方法和低温冷冻法进行RA寒证模型复制[6-7],即在实验开始前3天,用硫化钠和蒸馏水配制成的8%硫化钠作为脱毛剂,脱掉家兔肩背部提前选定的6个点和双后腿膝关节周围的毛。将4 mg/mL的卵蛋白溶液和等量的弗氏完全佐剂(CFA)混合液每个点皮下注射0.2 mL。两星期后再以同样的方法、剂量每点重复皮下注射1次。第2次免疫完成后6 d,将预先配制好的20 mg/mL卵蛋白生理盐水溶液向膝关节内分别注入0.4 mL。在24 h之内膝关节出现红肿触痛,表明模型复制成功。在模型复制成功后第2天,用70%乙醇消毒两后腿足,上、下、左、右围置冰袋(3份冰＋1份结晶氯化钙,粉碎混合,温度降至零下20～25℃)冷冻1.5 h,在45℃温水中复温5 min(室温12℃),共冷冻1次。冷冻后14 d,家兔表现为精神萎糜不振,两后肢匍伏跛行,膝关节肿胀,周径明显大于对照组,局部青紫,皮温不高,表示成功建立RA寒证模型。

1.4 处理方法

正常组(=8):不予任何处理,仅每日与针刺组同时给予捆绑和抓取刺激1次。

模型组(=8):造模成功后不予任何处理,仅每日与针刺组同时给予捆绑和抓取刺激1次。

平补平泻组(=8):造模成功后用兔台固定,以2%碘酒、75%乙醇消毒后,将华佗牌针灸针(0.25 mm× 40 mm)90°直刺刺入足三里穴内8 mm,施以平补平泻法1 min,留针30 min/次,1次/d,共7 d。平补平泻法操作方法参照《刺法灸法学》[8],针刺得气后,施以前后均匀捻转,指力均匀,角度180°～360°,频率60～90转/min,反复操作1 min。

捻转补法组(=8):造模成功后用兔台固定,以2%碘酒、75%乙醇消毒后,将华佗牌针灸针(0.25 mm× 40 mm)90°直刺刺入足三里穴内8 mm,施以捻转补法1 min,留针30 min/次,1次/d,共7 d。捻转补法操作方法参照《刺法灸法学》[8],针刺得气后,在针下得气处小幅度前后捻转针体(角度180°～360°,频率60～90转/min),拇指向前左转时用力重,指力沉重向下;拇指向后右转还原时用力轻,反复操作1 min。

热补针法组(=8):造模成功后用兔台固定,以2%碘酒、75%乙醇消毒后,将华佗牌针灸针(0.25 mm× 40 mm)90°直刺刺入足三里穴内8 mm,施以热补法1 min,留针30 min/次,1次/d,共7 d。热补针法操作参照《郑氏针灸全集》[1],操作者左手拇指紧按穴位,右手持针刺入穴内8～12 mm,针刺得气后,左手加重压力,右手拇指向前连续捻按5次;待针下沉紧后针尖拉着有感应的部位,连续重插轻提5次;拇指再向前连续捻按5次,反复操作1 min,最后使针下沉紧,留针30 min。

家兔足三里穴取穴参照《实验针灸学》[9]家兔常用针灸穴位定位标准并以比较解剖学为依据定位。

1.5 膝关节周径

造模成功后第2天和干预7 d后,在已褪毛的家兔后肢膝关节股骨内外髁用记号笔标记好固定的两点,用千分卡尺和皮尺在固定点测量膝关节周径,观察实验前后关节周径之间的变化。

1.6 滑膜组织病理切片炎症积分

滑膜病理切片炎性反应程度为4个级别,0分为正常滑膜;1分为少量中性粒细胞浸润;2分为大量粒细胞浸润、少量血管增生;3分为滑膜血管扩张、增生,滑膜绒毛增生变厚。干预7 d后比较各组间滑膜组织病理切片炎症积分。

1.7 标本采集和指标检测

组织切片制备:采用组织化学染色法观察组织LDH、SDH和CCO。将家兔处死,迅速采取关节滑膜组织。恒冻箱切片机切片,厚6mm,贴于盖玻片上风干。LDH、SDH和CCO染色严格按照染色试剂盒说明进行制备。

组织切片定量分析:组织切片经Image pro图像分析系统对关节滑膜细胞的LDH、SDH和CCO阳性沉淀的图像分析。计算机软件分析[Pixel2]表示像素平方,主要用于计算酶染色阳性图像面积,Areasum[Pixel2]表示阳性总面积;面积百分比是关键性指标,表示阳性面积占整个图片百分数,反映酶相对活性强度;积分光度则是通过酶染色的深浅程度来体现酶活性的大小。

1.8 统计学方法

所有统计均用SPSS for windows 18.0软件分析。计量资料符合正态分布采用均数±标准差表示,组间均数比较用单因素方差分析,两两比较采用法,＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膝关节周径

表1显示,针刺干预后,平补平泻组、捻转补法组、热补针法组都能减少RA家兔膝关节周径(＜0.05),但热补针法组减少RA家兔的膝关节周径作用优于平补平泻组和捻转补法组(＜0.05)。

表1 各组家兔实验前后膝关节周径变化比较 (±s,cm)

表1 各组家兔实验前后膝关节周径变化比较 (±s,cm)

组别n造模后干预后 正常组812.66±0.2312.65±0.19 模型组813.28±0.3113.27±0.25 平补平泻组813.05±0.5412.90±0.411)3) 捻转补法组813.17±0.4612.92±0.381)2)3) 热补针法组813.24±0.3612.75±0.571)2)

注:与造模后比较1)＜0.05;与平补平泻组比较2)＜0.05;与热补针法组比较3)＜0.05

2.2 滑膜组织病理切片炎症积分

表2示,热补针法组对减少RA家兔的关节滑膜组织病理切片炎症积分优于平补平泻组和捻转补法组。

表2 各组家兔干预后关节滑膜组织病理切片炎症积分比较 (±s,分)

表2 各组家兔干预后关节滑膜组织病理切片炎症积分比较 (±s,分)

组别n3分2分1分0分 正常组80008 模型组87100 平补平泻组86200 捻转补法组85300 热补针法组82141

2.3 热补针法对RA家兔关节滑膜LDH活性的影响

表3、图1显示,模型组、平补平泻组、捻转补法组和热补针法组家兔滑膜LDH积分光度、阳性总面积、面积百分比均显著高于正常组(＜0.05);与模型组比较,平补平泻组、捻转补法组和热补针法组滑膜LDH积分光度、阳性总面积、面积百分比均显著降低(＜0.05),但仍高于正常组(＜0.05);热补针法组LDH积分光度、阳性总面积、面积百分比均显著低于平补平泻组和捻转补法组(＜0.05)。

表3 各组家兔关节滑膜LDH活性变化比较 (±s)

表3 各组家兔关节滑膜LDH活性变化比较 (±s)

组别n积分光度(OD值)阳性总面积(μm2)面积百分比(%) 正常组847.91±4.903119.88±316.5214.33±3.42 模型组870.35±4.991)4564.75±352.161)29.84±5.761) 平补平泻组864.38±4.862)4176.25±264.532)25.55±3.682) 捻转补法组859.11±4.352)3792.75±319.612)3)21.49±2.792)3) 热补针法组853.07±4.682)3)4)3451.38±333.392)3)4)17.49±2.562)3)4)

注:与正常组比较1)＜0.05;与模型组比较2)＜0.05;与平补平泻组比较3)＜0.05;与捻转补法组比较4)＜0.05

注:A正常组,B模型组,C平补平泻组,D捻转补法组,E热补针法组

2.4 热补针法对RA家兔关节滑膜SDH活性的影响

表4、图2显示,模型组家兔滑膜SDH积分光度、阳性总面积、面积百分比显著高于正常组(＜0.05),说明RA自身可提高机体SDH活性;平补平泻组、捻转补法组和热补针法组家兔滑膜SDH积分光度、阳性总面积、面积百分比均显著高于模型组(＜0.05);热补针法组SDH积分光度、阳性总面积、面积百分比显著高于平补平泻组和捻转补法组(＜0.05)。

表4 各组家兔关节滑膜SDH变化 (±s)

表4 各组家兔关节滑膜SDH变化 (±s)

组别n积分光度(OD值)阳性总面积(μm2)面积百分比(%) 正常组810.50±2.433627.88±388.6410.70±2.16 模型组818.64±4.611)4202.13±460.741)17.24±4.491) 平补平泻组825.96±4.642)4856.50±474.782)22.73±5.202) 捻转补法组831.81±5.362)3)5564.75±620.762)28.39±4.992)3) 热补针法组837.22±6.002)3)4)6645.00±765.142)3)4)34.25±5.572)3)4)

注:与正常组比较1)＜0.05;与模型组比较2)＜0.05;与平补平泻组比较3)＜0.05;与捻转补法组比较4)＜0.05

注:A正常组,B模型组,C平补平泻组,D捻转补法组,E热补针法组

2.5 热补针法对RA家兔关节滑膜CCO活性的影响

表5、图3显示,模型组CCO积分光度、阳性总面积、面积百分比显著高于正常组(＜0.05);平补平泻组、捻转补法组和热补针法组CCO积分光度、阳性总面积、面积百分比显著高于模型组(＜0.05);热补针法组CCO积分光度、阳性总面积、面积百分比显著高于平补平泻组和捻转补法组(＜0.05)。

表5 各组家兔滑膜CCO活性变化 (±s)

表5 各组家兔滑膜CCO活性变化 (±s)

组别n积分光度(OD值)阳性总面积(μm2)面积百分比(%) 正常组858.55±5.863294.75±344.5814.26±3.01 模型组868.98±7.461)3863.25±283.781)18.22±3.011) 平补平泻组876.79±4.472)4368.75±450.012)22.35±4.112) 捻转补法组884.63±4.902)3)5071.75±489.382)3)26.40±4.522)3) 热补针法组896.42±9.822)3)4)6307.75±677.822)3)4)31.13±3.822)3)4)

注:与正常组比较1)＜0.05;与模型组比较2)＜0.05;与平补平泻组比较3)＜0.05;与捻转补法组比较4)＜0.05

3 讨论

热补针法是简化烧山火和进火补而来的,临床证实热补针法能够使机体局部产生热感[10-12],具有“取热”效应,说明机体局部的能量代谢发生了变化。因此,本实验选择与能量代谢相关的酶SDH和CCO作为指标,观察热补针法对RA模型家兔能量代谢的影响。

卵蛋白诱导的RA模型有滑膜组织大量增生、炎症细胞浸润过程,能很好地模拟人RA病理过程,而且病理过程至少持续8星期,在家兔等较大型动物上能够复制,是研究RA理想的模型[13]。但是,卵蛋白诱导的RA模型关节局部始终红肿热痛,能量代谢异常活跃,类似于人RA发病早期的“热痹”。冷冻一次后,关节局部皮温逐渐降低,血沉加快,红细胞压积下降,纤维蛋白原增加,肢体血流缓慢,流量减少,与人RA后期的“寒痹”和“风寒湿阻证”相似[7]。前期的预实验观察发现,冻后第14天,皮温降至正常或者稍低,说明低温应激能使机体能量代谢下降。中医所谓“寒”就是低温环境刺激,这种单纯疾病动物模型过程中融入中医病因因素,既符合现代医学RA病理特点,又体现了中医辨证论治的特色。

LDH是糖无氧酵解的关键酶,广泛存在于组织细胞内,主要作用是催化乳酸与丙酮酸之间的反应,葡萄糖通过无氧酵解最后被LDH催化生成乳酸。机体在病理条件下,LDH活性增强,催化乳酸氧化,这是机体自动调节的保护性代偿机制。当滑膜组织缺氧时,滑膜细胞生理功能被破坏,发生一系列病理生化变化,滑膜细胞变性释放出LDH,细胞被破坏越多,LDH活性越强。本实验结果显示,模型组、平补平泻组、捻转补法组和热补针法组家兔滑膜LDH活性均显著高于正常组。这是由于RA造模成功后,抗原刺激滑膜细胞活化增殖,促使滑膜处于炎症状态,释放LDH增多,丙酮酸被LDH催化产生大量乳酸,乳酸在体内的大量堆积又会导致机体疲乏无力。这一现象与本实验造模成功后,家兔精神萎靡、活动量减少相符合。说明RA模型家兔疲劳,活动减少,精神欠佳等表现不仅与产生的白介素、花生四烯酸等炎性介质相关,也可能与炎症刺激后LDH活性增强,产生大量乳酸有关。针刺治疗1星期后,平补平泻组、捻转补法组和热补针法组滑膜LDH活性均向正常水平恢复,说明各种针刺方法均可使LDH活性降低,这可能是因为针刺可以增强局部血液循环,从而增强了供氧能力,使机体局部组织缺氧状态得到改善,细胞有氧呼吸增强,相应的无氧呼吸开始减弱,LDH活性也逐渐降低。但是热补针法降低LDH活性要优于平补平泻法和捻转补法。研究发现[14]疲劳大鼠骨骼肌中LDH含量明显增高,通过服用抗疲劳中药能明显降低血清LDH[15],这与本实验结果一致。

SDH存在于所有有氧呼吸细胞的线粒体内膜上,为有氧代谢-三羧酸循环的限速酶和线粒体的标志酶,其活性可直接影响琥珀酸氧化呼吸链反应,与细胞能量供应密切相关[16],可作为反映和评价三羧酸循环的强弱标准。CCO是线粒体内膜呼吸链的关键酶,可催化还原型细胞色素C氧化,并将电子转移到氧分子形成水。这一反应伴随着氧化磷酸化过程并产生ATP[17],其活性的改变直接影响着细胞能量代谢的过程,进而影响整个滑膜细胞功能,线粒体中CCO表达的提高有助于维持和改善线粒体呼吸及能量代谢功能。

本实验中SDH和CCO活性改变高度相似。模型组家兔滑膜SDH和CCO活性显著高于正常组,说明RA自身可升高机体SDH和CCO活性,这可能是RA模型家兔早期关节温度增高的原因之一。经过针刺治疗1星期后,与模型组相比较,平补平泻组、捻转补法组和热补针法组家兔SDH和CCO活性均显著升高,提示这3种针刺方法均能引起SDH和CCO活性增强;热补针法组SDH和CCO活性显著高于平补平泻组和捻转补法组,说明热补针法在升高SDH和CCO活性方面要强于平补平泻法和捻转补法,这是因为针刺增强了机体有氧代谢能力,生成更多的能量满足机体的需要。这种针刺现象仅是存在于RA机体,还是一个普遍的规律,有待于进一步深入研究。关卫等[18]研究表明石氏针刺补法能够明显增强健康小鼠胃及骨骼肌SDH活性,与本实验结果有相似之处。

机体的温度是由糖、脂肪、蛋白质等营养物质分解释放出热量来维持的,有无氧代谢和有氧代谢两条途径,释放能量的过程中有许多能量代谢相关酶参与。LDH是无氧代谢酶,而SDH和CCO是有氧代谢酶,以上的结果提示针刺能够增强有氧代谢酶的活性从而增强有氧代谢,热补针法的作用强于平补平泻法和捻转补法。增强机体有氧代谢,使机体产生更多的能量,部分转化为热能散出体外,这可能就是热补针法“取热”的机制。但是机体能量代谢是一个涉及多个环节的复杂过程,仅从两个能量代谢相关酶的变化要得出上述结论为时尚早,还需要进一步的深入研究。

综上所述,热补针法治疗RA疗效确切,能够增强SDH、CCO活性,这可能就是热补针法“取热”的机制之一。

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Effect of Heat Reinforcing Acupuncture Manipulation on Articular Synovium LDH, SDH and CCO in Rheumatoid Arthritis Rabbits

DU Xiao-zheng1, WANG Jin-hai2, QIN Xiao-guang1, FANG Xiao-li1, ZHANG Xiao-jiang1.

1.Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000,China; 2.Lanzhou University Second Hospital, Lanzhou 730000,China

Objective To investigate the regulating effect of heat reinforcing acupuncture manipulation on body energy metabolism enzymes in rheumatoid arthritis (RA) and preliminarily explain the mechanism of heat-producing action of heat reinforcing acupuncture manipulation. Method Forty chinchilla rabbits were randomized into normal, model, equal reinforcement and reduction, twirling reinforcement, and heat reinforcing acupuncture manipulation groups. A model of cold syndrome-type RA was made by ovalbumin induction and exposure to low temperature in the other four groups not including the normal group. From two days after successful model making, the normal and model groups were grabbed and fastened (bound) by the same way as for the acupuncture groups, 30 min once daily. The equal reinforcement and reduction group received even reinforcing-reducing method; the twirling reinforcement group, twirling reinforcement method; the heat reinforcing group, heat reinforcing acupuncture manipulation. The needle was manipulated for 1 min and retained for 30 min once daily, for a total of seven days. The RA rabbit knee joint circumference was measured and the inflammation score was recorded according to synovial histopathological sections before and after treatment. After the completion of intervention, the rabbits were sacrificed and the articular synovium was rapidly separated for frozen sections. Articular synovium lactate dehydrogenase (LDH), succinate dehydrogenase (SDH) and cytochrome oxidase (CCO) activities were measured by histochemical staining. Result After acupuncture intervention, the RA rabbit knee joint circumference was shortened in all the equal reinforcement and reduction, twirling reinforcement, and heat reinforcing acupuncture manipulation groups, but the shortening effect on the RA rabbit knee joint circumference was better in the heat reinforcing acupuncture manipulation group than in the equal reinforcement and reduction and twirling reinforcement method groups (＜0.05); the inflammation score recorded according to the RA rabbit synovial histopathological sections was also decreased more in the heat reinforcing acupuncture manipulation group than in the equal reinforcement and reduction and twirling reinforcement method groups (＜0.05). Synovial LDH integral optical density, total positive area and area percentage were significantly higher in the model group than in the normal group (＜0.05), and significantly lower in the equal reinforcement and reduction, twirling reinforcement, and heat reinforcing acupuncture manipulation groups than in the model group(＜0.05) and also in the heat reinforcing acupuncture manipulation group than in the equal reinforcement and reduction and twirling reinforcement method groups (＜0.05). Rabbit synovial SDH and CCO activities were significantly higher in the model group than in the normal group (＜0.05). Rabbit synovial SDH and CCO integral optical density, total positive area and area percentage were significantly higher in the equal reinforcement and reduction, twirling reinforcement, and heat reinforcing acupuncture manipulation groups than in the model group (＜0.05) and also in the heat reinforcing acupuncture manipulation group than in the equal reinforcement and reduction and twirling reinforcement method groups (＜0.05). Conclusion Heat reinforcing acupuncture manipulation has a definite therapeutic effect on RA and can increase SDH and CCO activities to enhance aerobic metabolism and produce more local energy in a rabbit model of RA. That may be the mechanism by which heat reinforcing acupuncture manipulation produces heat.

Acupuncture reinforcing method; Arthritis, rheumatoid; Lactate dehydrogenase; Succinate dehydrogenase; Cytochrome oxidase

1005-0957(2016)10-1256-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.10.1256

2015-12-20

甘肃省教育厅第二批科研项目(1106B-08);甘肃中医药大学中青年科研基金项目(gszyxy2010-4)

杜小正(1973 - ),男,副教授,博士,研究方向为传统针刺手法治疗免疫系统疾病,Email:lz-duxiaozheng@163.com