电针对溃疡性结肠炎大鼠结肠IL-1b及nAchRa7mRNA的影响

易细芹,张泓,凌希,吴金峰,艾坤,邓石峰



电针对溃疡性结肠炎大鼠结肠IL-1b及nAchRa7mRNA的影响

易细芹,张泓,凌希,吴金峰,艾坤,邓石峰

(湖南中医药大学针灸推拿学院,长沙 410208)

目的 对比观察电针溃疡性结肠炎大鼠上巨虚、足三里、下巨虚、阳陵泉等穴后对结肠组织白介素-1b(IL-1b)及烟碱型乙酰胆碱受体a7信使核糖核酸(nAchRa7mRNA)表达的影响,探讨大肠下合穴上巨虚治疗对应腑病是否存在相对特异性。方法 将70只健康SD大鼠随机分为空白组、模型组、上巨虚组、足三里组、下巨虚组、阳陵泉组及承筋组,每组10只,雌雄各半。除空白组外均采用2-4-6三硝基苯磺酸/乙醇溶液灌肠诱导建立大鼠溃疡性结肠炎模型,造模成功并治疗10 d后,肉眼观察大鼠结肠黏膜溃疡及炎症情况,ELISA法检测大鼠结肠组织中IL-1b含量,RT-PCR检测nAchRa7mRNA的表达。结果 与模型组比,各穴位组结肠损伤有不同程度好转,组织IL-1b含量明显偏低而nAChRa7mRNA表达均较高(＜0.05,＜0.01),且上巨虚组、足三里组结肠溃疡评分亦较低(＜0.05,＜0.01);与上巨虚组比,其他4个穴位组结肠nAChRa7mRNA表达均较低(＜0.01),而下巨虚组、阳陵泉组、承筋组结肠溃疡及炎症损伤较严重,结肠溃疡评分及IL-1b含量均偏高(＜0.05,＜0.01)。结论 电针治疗溃疡性结肠炎的机制可能是通过影响IL-1b、nAchRa7mRNA等调节异常的免疫功能,改善结肠黏膜损伤等来实现的;上巨虚治疗溃疡性结肠炎的总体效应优于足三里、下巨虚、阳陵泉及承筋穴,说明上巨虚穴与对应大肠腑之间存在一定的相对特异性。

电针;穴,下合;结肠炎,溃疡性;大鼠;IL-1b;nAchRa7mRNA;合治内府

以经典理论为基础探讨腧穴的特异性正在兴起,“合治内府”之“合”穴的特异性即成为研究的热点之一。下合穴是六腑下合于足三阳经的特定穴,《灵枢·本输》:“六腑皆出足之三阳”,结合“手三阳无腑证”的认识,“合治内府”之“合”应为腑之下合穴而非经之合穴。我们前期也观察到上巨虚、下巨虚穴治疗相应腑病的效应分别优于曲池与小海穴[1-2],为证实“合治内府”之“合”的内涵提供了部分实验依据。近年来大量研究证实针灸下合穴治疗对应内腑病变有着良好的疗效[3-5]。与消化系统生理病理相关内腑的下合穴基本上位处同一神经节段,且上巨虚、足三里、下巨虚均隶属于足阳明胃经,其与对应内腑之间是否存在相对特异性?古典医籍均无明确记载,现代临床与实验也鲜有报道。针对上述问题,我们以溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)大鼠为实验模型,通过电针刺激胃、肠、胆腑下合穴等,对比观察不同穴组对UC大鼠结肠溃疡及炎症评分、组织白介素-1b(Interleukin-1b,IL-1b)及烟碱型乙酰胆碱受体a7信使核糖核酸(neuronal acetylcholine receptorsa7mRNA,nAchRa7mRNA)表达的影响,探讨大肠下合穴上巨虚治疗大肠腑病UC是否存在相对特异性,为临床运用下合穴治疗大肠腑病提供部分实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物分组

SPF级SD大鼠70只,雌雄各半,体重(230±15)g,饲养温度20～25℃,湿度50%～70%,由湖南中医药大学动物实验中心提供(湖南省动物质量合格证编号为43004700003928)。大鼠适应性饲养10 d,随机分为7组,即空白组、模型组、上巨虚组、足三里组、下巨虚组、阳陵泉组、承筋组,每组10只,雌雄各半。

1.2 主要试剂与仪器

5% 2-4-6三硝基苯磺酸(Sigma公司),无水乙醇(上海国药生物),乌来糖(上海山浦化工公司),大鼠IL-1b酶联免疫分析试剂盒(武汉华美生物工程有限公司),逆转录试剂盒(Fermentas公司),Tris、EDTA、E.B.SYBGREEN PCR Mix和DEPC(Sigma公司),Trizol (Invitrogen公司),DL2000 DNA Marker、dNTP及Taq酶(Genstar公司),引物(上海生物工程)等;全套动物手术器械、CBV-1500A型无菌工作台(上海瑞仰净化装备有限公司),毫针(规格0.30 mm×25 mm,苏州医疗用品厂有限公司),SDZ-V型电针治疗仪(苏州医疗用品厂有限公司),5810R型高速冷冻离心机(Eppendorf公司),荧光定量PCR仪和荧光PCR板恒温水浴箱(Thermo公司)等。

1.3 模型制备

参考文献[6]并改良后进行造模,造模前大鼠禁食不禁水24 h,以25%乌拉坦腹腔注射麻醉(0.5 mL/ 100 g),采用大鼠灌胃针头轻轻从肛门沿肠腔插入8 cm,用注射器注入含30 mg三硝基苯磺酸(即2.5% TNBS0.6 mL)的50%乙醇溶液0.85 mL,快速捏紧肛门(防止药物溢出),5 min后仰卧归笼。待其清醒后常规饲养。造模后观察大鼠是否出现懒动、拱背、厌食、大便次数增多、便软或稀、大便末端有黏液等表现,出现1项记1分,无则记0分,并累计总分,2分及以上为造模成功。

实验过程中对动物的处置符合2009年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例[7]。

1.4 治疗方法

穴位选取根据《实验针灸学》[8]的方法并结合拟人比照法量取。上巨虚位于大鼠后肢上后三里穴下约5 mm处,直刺7 mm;足三里位于大鼠后膝关节外下方当腓骨小头下约5 mm处,直刺5 mm;下巨虚位于大鼠膝关节外侧胫骨外上髁下约15 mm,直刺5 mm;阳陵泉位于大鼠距后三里上外侧5 mm,直刺7 mm;承筋位于大鼠后肢小腿后面,腓肠肌肌腹中央,直刺7 mm。空白组不做任何处理,模型组每天只捆绑不针刺30 min;穴位组每天捆绑并行电针治疗。使用SDZ-V型华佗牌电针治疗仪,参数为疏密波(10/50 Hz),左正右负,强度1～3 mA,以肢体出现震颤为度,留针30 min,每天1次,治疗10 d。

1.5 样本的采集与处理

治疗结束后各组大鼠用25%乌拉坦按0.5 mL/ 100 g的剂量行腹腔麻醉,立即开腹从肛门向上剖取8 cm结肠组织,并沿肠系膜纵轴方向剪开肠腔,迅速用冰生理盐水冲洗后,于10倍放大镜下行肉眼下溃疡及炎症评分,再从肠近端至远端取一份约100 mg结肠组织,迅速置于﹣70℃低温冰箱保存,待做ELISA法检测IL-1b含量,另取出一块约150 mg左右的结肠组织于液氮中保存待做nAchRa7mRNA的实时荧光定量PCR检测。

1.6 检测指标

1.6.1 结肠组织肉眼溃疡及炎症评分

参照朱峰等[9]评分标准,0分为无损伤;1分为黏膜充血、水肿,但未出现溃疡;2分为黏膜充血、水肿、轻度糜烂,无溃疡;3分为黏膜充血、水肿、中度糜烂,有单个溃疡;4分为黏膜充血、水肿、高度糜烂,有多处溃疡;5分为黏膜充血、水肿、重度糜烂,有＞1 cm溃疡。

1.6.2 结肠组织IL-1b的检测

组织IL-1b含量检测采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法,具体按照试剂盒步骤操作,取约0.1 g组织加入1 mL PBS液研磨匀浆;于4℃,5000×,离心5 min后取上清,上清液于﹣20℃反复冻融3次;用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。建立标准曲线后加样,每孔中加入上清100mL,封板置37℃恒温箱中120 min;洗板5次后每孔加入第一抗体工作液50mL,旋涡振荡器上混匀后封板置37℃恒温60 min;洗板5次后每孔加入酶标抗体工作液100mL,混匀后封板置37℃恒温箱60 min;洗板5次每孔加入底物液100mL,混匀后封板37℃置恒温箱反应10 min;每孔加入终止液50mL,混匀,立即在450 nm波长下测定吸光度值,通过标准曲线计算样品中IL-1b的含量。样品实际浓度=标准曲线计算值/相对蛋白定量。

1.6.3 结肠组织nAchRa7mRNA的检测

组织中nAchRa7mRNA采用实时荧光定量PCR法检测,具体步骤如下。按Trizol试剂的使用操作步骤提取组织总RNA,进行RNA的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的纯度。以b-肌动蛋白(b-actin)基因为内参,在NCBI上搜索目的基因的序列,运用Primer5软件设计,由南京金斯瑞合成引物,设计nAchRa7的引物序列,扩增引物见表1。

表1 nAChRa7和b-actin内参基因引物序列

按照逆转录试剂盒说明以组织总mRNA为模板,逆转录cDNA,采用随机引物,按照反转录试剂盒的操作说明在普通PCR仪上进行逆转录,合成第一条cDNA链,总的反应体积是20mL,再以1mL逆转录反应产物为模板,采用SYBR法,按照荧光实时定量PCR试剂盒的说明,冰上配置30mL的PCR反应体系。RT-PCR反应条件为95℃预变性10 min,95℃变性10 s, 59℃退火/延伸50 s。扩增40个循环,并于60～95℃采集熔解曲线,根据PCR产物熔解曲线的平均熔解温度确定产物的纯度。如果产物特异,则熔解曲线无杂峰,平均熔解温度一致。以b-actin的Ct值校正目的基因Ct值,实验结果采用2﹣ΔΔCt法,计算目的基因mRNA转录水平的差异。

1.7 统计学方法

所有数据使用SPSS17.0软件处理,用均数±标准差表示,所有资料均进行正态性检验,多组计量资料采用单因素方差分析法。溃疡评分数据不符合正态分布,采用秩和检验;组织nAchRa7mRNA数据满足正态性但不满足方差齐性,采用’3法;组织IL-1b数据满足正态性且方差齐性,采用法。以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

模型组大鼠造模后疑因溃疡穿孔死亡2只,阳陵泉组治疗过程中疑因病情恶化死亡1只,故纳入统计大鼠67只。

2.1 结肠溃疡及炎症组织肉眼图片及评分结果

如图1所示,空白组大鼠结肠黏膜正常;模型组大鼠结肠黏膜充血、水肿、糜烂,有溃疡;上巨虚组及足三里组黏膜充血、水肿均较轻,无明显糜烂,未见溃疡;下巨虚组、阳陵泉组、承筋组结肠黏膜充血、水肿、糜烂较重,可见溃疡。图中箭头所指为结肠组织损伤明显处。

注:A-空白组,B-模型组,C-上巨虚组,D-足三里组,E-下巨虚组,F-阳陵泉组,G-承筋组

图1 各组大鼠结肠溃疡组织肉眼图片

如表2所示,与空白组比较,余组结肠溃疡及炎症评分明显偏高,差异有统计学意义(＜0.05,＜0.01);与模型组比较,上巨虚组、足三里组溃疡评分明显偏低,差异有统计学意义(＜0.05,＜0.01),下巨虚组、阳陵泉组、承筋组溃疡评分降低,但差异无统计学意义(＞0.05);与上巨虚组比较,下巨虚组、阳陵泉组、承筋组溃疡评分均偏高,差异有统计学意义(＜0.05,＜0.01),足三里组与之比较差异无统计学意义(＞0.05);与足三里比较,除承筋组评分较高,差异有统计学意义(＜0.05)外,下巨虚、阳陵泉组与之比较差异无统计学意义(＞0.05)。

表2 各组大鼠结肠组织黏膜溃疡及炎症评分比较(±s,分)

表2 各组大鼠结肠组织黏膜溃疡及炎症评分比较(±s,分)

组别n溃疡及炎症评分 空白组100.30±0.48 模型组83.25±1.042) 上巨虚组101.20±0.921)4) 足三里组101.90±0.992)3) 下巨虚组102.40±1.072)5) 阳陵泉组92.44±0.882)5) 承筋组103.10±0.122)6)7)

注:与空白组比较1)＜0.05,2)＜0.01;与模型组比较3)＜0.05,4)＜0.01;与上巨虚组比较5)＜0.05,6)＜0.01;与足三里组比较7)＜0.05

2.2 各组大鼠结肠组织中IL-1b含量比较

如表3所示,与空白组比较,模型组、下巨虚组、阳陵泉组、承筋组结肠组织IL-1b含量均偏高,差异有显著统计学意义(＜0.01),足三里组、上巨虚组IL-1b増高,但差异无统计学意义(＞0.05);与模型组比较,5个穴位组结肠组织IL-1b含量明显偏低,差异有显著统计学意义(＜0.01);与上巨虚组比较,下巨虚组、阳陵泉组、承筋组结肠组织IL-1b含量明显偏高,差异有统计学意义(＜0.05,＜0.01),足三里组与之比较差异无统计学意义(＞0.05);与足三里组比较,下巨虚组、阳陵泉组、承筋组结肠组织IL-1b含量均偏高,差异有统计学意义(＜0.05)。

表3 各组大鼠结肠组织中IL-1b含量比较(±s,pg/mL)

表3 各组大鼠结肠组织中IL-1b含量比较(±s,pg/mL)

组别nIL-1b 空白组1055.19±12.88 模型组8115.05±20.401) 上巨虚组1064.12±9.152) 足三里组1066.05±16.372) 下巨虚组1081.60±13.051)2)3)5) 阳陵泉组983.12±19.411)2)4)5) 承筋组1083.68±12.221)2)4)5)

注:与空白组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01;与上巨虚组比较3)＜0.05,4)＜0.01;与足三里组比较5)＜0.05

2.3 各组大鼠结肠中nAChRa7mRNA表达比较

如表4所示,与空白组比较,余组结肠nAChRa7mRNA表达明显偏低,差异有显著统计学意义(＜0.01);与模型组比较,各穴位组结肠nAChRa7mRNA表达均较高,差异有统计学意义(＜0.05,＜0.01);与上巨虚组比较,其他4个穴位组结肠nAChRa7mRNA表达均较低,差异有显著统计学意义(＜0.01);与足三里组比较,阳陵泉组、承筋组结肠nAChRa7mRNA表达明显偏低,差异有显著统计学意义(＜0.01),而下巨虚组与之比较差异无统计学意义(＞0.05);与下巨虚组比较,阳陵泉组、承筋组结肠nAChRa7mRNA表达偏低,差异有显著统计学意义(＜0.01);与阳陵泉组比较,承筋组nAChRa7mRNA较低,差异有显著统计学意义(＜0.01)。

表4 各组大鼠结肠组织中nAChRa7mRNA表达比较(±s)

表4 各组大鼠结肠组织中nAChRa7mRNA表达比较(±s)

组别nnAChRa7mRNA 空白组101.06±0.11 模型组80.33±0.031) 上巨虚组100.85±0.041)3) 足三里组100.72±0.061)3)4) 下巨虚组100.65±0.041)3)4) 阳陵泉组90.54±0.051)3)4)5)6) 承筋组100.40±0.041)2)4)5)6)7)

注:与空白组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.05,3)＜0.01;与上巨虚组比较4)＜0.01;与足三里组比较5)＜0.01;与下巨虚组比较6)＜001;与阳陵泉组比较7)＜0.01

3 讨论

《灵枢·邪气脏腑病形》提出“合治内府”,意指下合穴治疗腑病。临床下合穴治疗腑病疗效显著[10-13],基于“合治内府”理论研究下合穴临床应用的相对特异性成为重要命题之一。溃疡性结肠炎是临床常见的消化系统疾病,在我国发病率呈逐年上升的趋势[14],是典型的大肠腑病。本项目借助UC模型大鼠为研究对象,通过对比观察电针紧密联系的与消化系统相关的不同下合穴对UC的疗效,并以位置相近的非下合穴承筋作为对照,探讨上巨虚治疗大肠腑病是否存在相对特异性,为证实经典理论“合治内府”部分内涵进行有益的尝试。

针灸疗法有双向良性调整作用,可以调节免疫功能,并能有效抗击炎症反应[15]。肠道黏摸本身是一个重要的免疫器官,在免疫屏障和抗黏膜损伤等方面起着重要的作用。当UC发生时,结肠肠道黏膜被破坏,表现为结肠充血、水肿、有炎性渗出物,结肠重量、组织损伤评分及过氧化物酶活性均显著增加[16]。研究[17]发现电针可显著改善UC大鼠造模后导致的形态学上细胞结构的变化。免疫系统调节异常是UC发病的中心环节,而细胞因子在免疫调节过程中起关键作用。IL-1b可激活补体、吞噬细胞及杀伤细胞的活性,增强体液免疫和细胞免疫介导组织损伤过程。白细胞介素(IL-1b、IL-6、IL-8)与UC患者临床症状、活动度、内镜表现及组织学分级明显相关,且能够有效反映患者病情变化[18],当发生肠道炎症时,IL-1b比其他炎症因子有更明显的优势,IL-1Ra(IL-1受体拮抗剂)/IL-1比例与炎症程度呈显著负相关。nAchRa7具有调节神经元兴奋性的功能,可使神经元处于一种合适的生理状态[19]。研究[20]认为ACh、a7nAChR激动剂剂量能够发挥阻止LPS产生炎性因子但不会阻碍抗炎因子IL-10产生,其机制在于借助nAChR介导有效地阻碍蛋白合成。实验结果说明,nAChRa7亚基是该机制中最为核心的因素[21]。UC属于炎症性肠病,免疫系统异常反应对UC发病起着关键性的作用[22],而nAChRa7介导的一系列神经免疫调节作用在UC治疗中占据着举足轻重的地位。研究[23]显示a7nAChR激动剂八角枫碱可明显抑制三硝基苯磺酸诱导的结肠炎炎症反应。研究[24-26]表明,尼古丁(a7nAChR激动剂)有镇痛、降低IL-1和IL-8水平、减轻肠道炎症反应及不适症状的功能。另有研究发现抑制ACh的分解亦可降低a7nAChR介导的炎症细胞因子释放,改善葡聚糖硫酸钠诱导的实验性结肠炎[27]。

本实验中,肉眼观察UC模型组大鼠结肠组织可见黏膜充血、水肿、糜烂,有溃疡,且结肠溃疡及炎症评分和组织IL-1b含量明显高于空白组,nAChRa7mRNA表达则较低,说明在外来抗原刺激下,大鼠肠黏膜免疫系统被激活,黏膜自身免疫性炎症损伤增加,提示造模成功。电针治疗后,各穴位组与模型组比较大鼠结肠溃疡及炎症肉眼观察均有不同程度的改善,溃疡及炎症评分和IL-1b含量均较低,nAChRa7mRNA表达均偏高,说明电针穴位可调节异常的免疫功能,降低免疫细胞对炎症的反应性,从而减轻炎症。进一步比较可知,上巨虚组上述效果均明显优于下巨虚组、阳陵泉组及承筋组,且结肠nAChRa7mRNA表达高于足三里组,提示上巨虚治疗UC具有一定的相对特异性。另足三里组疗效优于承筋组,部分疗效较下巨虚组和阳陵泉组明显,提示电针足三里对UC的疗效相对较好,这与胃、大肠功能上下相承一致,以往的研究[28-29]也有相关报道。

综上所述,电针与消化系统相关的下合穴等均可对UC模型大鼠产生不同程度的治疗作用,其机制应是通过影响IL-1b、a7nAchRmRNA等调节异常的免疫功能,改善肠道黏膜损伤等来实现的;上巨虚治疗UC的总体效应优于足三里、下巨虚、阳陵泉及承筋穴,说明上巨虚穴与对应大肠腑之间存在一定的相对特异性。

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Effect of Electroacupuncture on Colonic IL-1band nAchRa7mRNA in Ulcerative Colitis Rats

YI Xi-qin, ZHANG Hong, LING Xi, WU Jin-feng, AI Kun, DENG Shi-feng.

Hunan University of Traditional Chinese Medicine School of Acupuncture and Massage, Changsha 410208,China

Objective To compare the effects of electroacupuncture at points Shangjuxu(ST37), Zusanli(ST36), Xiajuxu(ST39) and Yanglingquan(GB34) on colonic expressions of interleukin-1b(IL-1b) and nicotinic acetylcholine receptora7 mRNA (nAchRa7mRNA) in ulcerative colitis rats and investigate if large intestine lower He-Sea point Shangjuxu has relative specificity to fu organ diseases. Method Seventy healthy SD rats were randomized into blank, model, Shangjuxu, Zusanli, Xiajuxu, Yanglingquan and Chengjin groups, 10 rats, half male and half female, each. A rat model of ulcerative colitis was made by induction of 2-4-6 three nitrobenzene sulfonic acid/ethanol solution enema in every group except the blank group. After successful model making and ten days of treatment, rat colonic mucosal ulcers and inflammation were observed macroscopically, colonic IL-1bcontent was measured by ELISA and the expression of nAchRa7mRNA was determined by RT-PCR. Result Compared with the model group, colonic lesions were reduced in varying degrees, colonic IL-1bcontent was significantly lower and the expression of nAchRa7mRNA was higher in every acupoint group (＜0.05,＜0.01); the colonic ulcer score was lower in the Shangjuxu and Zusanli groups (＜0.05,＜0.01). Compared with the Shangjuxu group, colonic expression of nAchRa7mRNA was lower in the other four acupoint groups (＜0.01); colonic mucosal ulcers and inflammatory lesions were more severe and the colonic ulcer score and the IL-1bcontent were higher in the Xiajuxu, Yanglingquan and Chengjin groups (＜0.05,＜0.01). Conclusion The mechanism of electroacupuncture treatment for ulcerative colitis may be that it regulates abnormal immunologic function by modulating IL-1band nAchRa7mRNA and reduces mucosal lesions. The overall therapeutic effect of Shangjuxu is better than those of Zusanli, Xiajuxu, Yanglingquan and Chengjin, indicating that Shangjuxu has relative specificity to fu organ large intestine.

Electroacupuncture; Point, lower He-Sea; Colitis, ulcerative; Rats; IL-1b; nAchRa7mRNA; Lower He-Sea point for fu organ diseases

1005-0957(2016)10-1251-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.10.1251

2016-02-20

国家自然科学基金项目(81173327/H2718)

易细芹(1989 - ),女,助教,硕士,Email:995010568@qq.com

张泓(1963 - ),男,教授,博士,Email:zh5381271@sina.com