依维莫司和AR-A014418联合使用促进黑素瘤细胞A375的凋亡

陈兰 荣冬芸 吴春维 曹煜

550001贵阳，贵州医科大学附属医院皮肤科

依维莫司和AR-A014418联合使用促进黑素瘤细胞A375的凋亡

陈兰 荣冬芸 吴春维 曹煜

550001贵阳，贵州医科大学附属医院皮肤科

目的 探讨同时抑制mTORC1激酶和GSK-3β激酶活性对黑素瘤细胞4EBP1的磷酸化、帽子依赖翻译、细胞存活和凋亡的影响。方法 分别采用二甲基亚砜（DMSO组）、5 nmol/L依维莫司（依维莫司组）、10 μmol/L AR-A014418（AR-A014418组）、5 nmol/L 依维莫司联合 10 μmol/L AR-A014418（联合处理组）处理A375细胞，Western印迹法检测4EBP1的磷酸化和生存素蛋白的表达，m7GTP pull-down实验检测eIF4E和eIF4G的相互作用，CCK8法和流式细胞仪分别检测A375细胞的增殖和凋亡。结果 依维莫司和AR-A014418对4EBP1磷酸化和生存素蛋白表达均有一定的抑制作用，两组p4EBP1-65分别为0.74±0.05和0.62±0.06，生存素蛋白分别为0.71±0.06和0.58±0.07，与DMSO组（分别为1.00±0.07和1.00±0.06）相比，均P＜0.001，且联合处理组对4EBP1磷酸化（0.14±0.04）和生存素蛋白表达（0.09±0.05）的抑制更为显著。m7GTP pull-down实验显示，依维莫司组（0.72±0.04）、AR-A014418组（0.67±0.05）、联合处理组（0.12±0.05）eIF4G 相对值均低于DMSO 组（1.00±0.06），而4EBP1相对值均高于DMSO 组（分别为 1.98±0.16、2.32±0.17、7.58±0.25、1.00±0.08），且联合处理组eIF4G降低和4EBP1增加最为显著。培养24 h时，与DMSO组相比，依维莫司、ARA014418、依维莫司联合AR-A014418均对A375细胞增殖有抑制作用（后3组抑制率分别为18.5%±1.3%、19.8%±1.8%、61.2%±2.1%），且联合处理组的抑制作用最为显著；培养48 h时，依维莫司和AR-A014418对A375细胞增殖的抑制显示相同的趋势，且其抑制作用随时间的延长而增强。流式细胞仪检测显示，依维莫司和AR-A014418单独处理A375细胞24 h对其凋亡有一定的促进作用（凋亡率分别为14.28%±2.18%、14.57%±2.35%），联合处理时细胞凋亡更为显著，凋亡率为55.18%±6.27%。结论 联合使用依维莫司和AR-A014418显著抑制A375细胞中4EBP1的磷酸化，进而抑制eIF4F蛋白复合物的形成，从而抑制帽子依赖的翻译，促进黑素瘤细胞的凋亡。

黑色素瘤，实验性；细胞凋亡；糖原合成酶激酶3；生存素；依维莫司；4E结合蛋白1；帽子依赖翻译

帽子依赖的翻译（cap-dependent translation）在黑素瘤的发生发展中发挥着重要的作用［1］。生存素是肿瘤细胞中重要的凋亡抑制蛋白，研究表明，生存素蛋白的翻译受帽子依赖的翻译调控［2］。细胞内部帽子依赖的翻译受真核细胞起始因子4F（eukaryotic initiation factor-4F，eIF4F）调控，eIF4F 蛋白复合物由eIF4E、eIF4A和eIF4G组成，而eIF4F的形成受真核细胞起始因子4E结合蛋白1（4E-binding protein-1，4EBP1） 调控，即未磷酸化的4EBP1能够与eIF4E结合，抑制eIF4E和eIF4G相互作用，进而抑制eIF4F蛋白复合物的形成，而磷酸化的4EBP1不能与eIF4E结合，解除了对eIF4F蛋白复合物形成的抑制作用［3-4］。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）作为4EBP1的激酶已经受到广泛而深入的研究［5-7］。最近的研究发现，糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）激酶可以通过与4EBP1之间的相互作用直接磷酸化4EBP1，进而解除非磷酸化的4EBP1对eIF4F蛋白复合物功能的抑制作用，从而促进受帽子依赖翻译调控的肿瘤相关蛋白的表达，促进肿瘤细胞体外增殖和裸鼠体内成瘤能力［8］。本研究通过协同抑制mTORC1激酶和GSK-3β激酶活性来抑制黑素瘤细胞的生长，使用mTORC1激酶抑制剂依维莫司（RAD001）和GSK-3β激酶抑制剂AR-A014418联合处理黑素瘤细胞A375，检测4EBP1磷酸化及eIF4F蛋白复合物的变化情况，并检测细胞的生长和凋亡情况。

材料与方法

一、细胞株及主要试剂

人黑素瘤细胞株A375由本实验室保存。依维莫司和AR-A014418（美国Selleck公司），m7GTP琼脂糖株（美国 Sigma公司），Cell Counting Kit-8（CCK8）试剂盒（日本同仁化学研究所），AnnexinVFITC细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），4EBP1抗体、磷酸化4EBP1（Ser65）抗体、eIF4E抗体、eIF4G抗体和c-Parp抗体（美国Cell Signaling Technology公司），Tubulin抗体（美国Santa Cruz公司）。

二、实验分组及处理

6孔或96孔细胞培养板培养A375细胞，待细胞贴壁后，分别用DMSO（DMSO组）、5 nmol/L依维莫司（依维莫司组）、10 μmol/L AR-A014418（ARA014418 组）、5 nmol/L 依维莫司联合 10 μmol/L AR-A014418（联合处理组）处理细胞，在CO2培养箱孵育，然后进行相关检测。

三、Western印迹法检测磷酸化4EBP1和生存素蛋白的表达

6孔细胞培养板中每孔接种5×104个细胞，待细胞贴壁后，按上述方法处理各组细胞。各组细胞在CO2培养箱孵育24 h后用冰冷的PBS清洗3次，使用蛋白裂解液裂解细胞，冰上静置30 min，4℃10 000×g离心10 min，收集上清液。蛋白样品与5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液按4∶1的比例混合，沸水浴加热5～10 min。冷却后进行SDS-PAGE电泳，半干转膜，5%脱脂奶粉封闭。封闭结束后将硝酸纤维素膜置于含5%脱脂奶粉以一定浓度稀释的一抗摇动孵育，TBST洗膜3次后孵育二抗（辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔/山羊抗鼠IgG），TBST洗膜3次，ECL底物发光显色试剂盒进行化学发光法显色。采用ImageJ软件对条带进行灰度分析，以Tubilin作为内参对磷酸化4EBP1和生存素蛋白的表达水平进行相对定量分析。

四、m7GTP pull-down实验

6孔细胞培养板中每孔接种5×104个细胞，待细胞贴壁，按上述方法处理各组细胞，在CO2培养箱孵育24 h后用冷PBS清洗3次，1 ml细胞裂解液于冰上裂解细胞25～35 min，4℃10 000×g离心10 min，取上清液加入m7GTP琼脂糖株15 μl，4℃翻转混合孵育3 h，4℃500×g离心3 min，弃上清液，离心收集m7GTP琼脂糖株，用结合缓冲液洗涤沉淀物3次，每次10 min。4℃500×g离心后，加入2×SDS蛋白上样缓冲液20μl，沸水浴加热5～10min，离心取上清液进行SDS-PAGE电泳，Western印迹法检测4EBP1、eIF4E和eIF4G的蛋白表达，以未进行pull-down的蛋白裂解液Lysate作为内参，比较药物处理后eIF4F蛋白复合物功能活性的变化。

五、CCK8法检测细胞活性

96孔细胞培养板中每孔接种2 000个细胞，待细胞贴壁后，按上述方法处理各组细胞。各组分别于培养 24、48 h后，每孔加入 CCK8溶液 10 μl，再将96孔细胞培养板置于CO2培养箱孵育2 h。用酶标仪测定450 nm处吸光度（A值）。每个时间点平行做3个孔，实验重复3次。

六、流式细胞仪检测细胞凋亡

收集细胞培养液到离心管内备用，PBS清洗细胞后将PBS加入离心管中，加入0.25%不含EDTA的胰蛋白酶消化液1 ml，置于CO2培养箱静置2 min左右，待细胞变圆，彼此不连接为止，加入3 ml新鲜培养液，吹打下所有的贴壁细胞收集到离心管内。300×g离心5 min，弃去上清液后用PBS洗涤细胞2次，500×g离心 5 min，弃去上清液后用 500 μl结合缓冲液重悬细胞，加入5 μl碘化丙啶和5 μl Annexin V-FITC混匀，避光室温孵育10 min。在488 nm激发波长处用流式细胞仪通过FITC通道检测Annexin V-FITC的绿色荧光和PI通道检测PI红色荧光（在染色后1 h内进行流式细胞仪检测）。使用正常培养的细胞作为对照进行荧光补偿调节。

表1 依维莫司和AR-A014418对真核起始因子4E结合蛋白1（4EBP1）磷酸化和生存素蛋白表达的抑制作用（±s）

表1 依维莫司和AR-A014418对真核起始因子4E结合蛋白1（4EBP1）磷酸化和生存素蛋白表达的抑制作用（±s）

注：n=3

组别 p4EBP1-65 生存素 4EBP1 DMSO组 1.00±0.07 1.00±0.06 1.00±0.09依维莫司组 0.74±0.05 0.71±0.06 0.94±0.08 AR-A014418组 0.62±0.06 0.58±0.07 1.06±0.07联合处理组 0.14±0.04 0.09±0.05 0.91±0.08 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05

七、统计学分析

结 果

一、依维莫司和AR-A014418对4EBP1磷酸化和生存素蛋白表达的抑制作用

Western印迹结果显示，依维莫司组、AR-A014418组、联合处理组p4EBP1-65、生存素蛋白表达均较DMSO组降低（均P＜0.05），而4组间4EBP1的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1，图1、2。析因分析显示，依维莫司和AR-A014418对4EBP1磷酸化和生存素表达均有一定的抑制作用（p4EBP1-65：F=154.231、193.634；生存素：F=115.2、213.4；均P＜0.001），且依维莫司与AR-A014418对4EBP1磷酸化和生存素蛋白表达的抑制有交互作用（F=16.321、25.691，P=0.004、0.001），根据相加模型判断为正交互作用。

图1 Western印迹法检测p4EBP1蛋白的表达 1～4：分别为DMSO组、依维莫司组、AR-A014418组、联合处理组。依维莫司组和AR-A014418组p4EBP1-65相对值有一定降低，而联合处理组显著降低

图2 Western印迹法检测生存素蛋白的表达 1～4：分别为DMSO组、依维莫司组、AR-A014418组、联合处理组。依维莫司组和AR-A014418组生存素蛋白表达有一定降低，而联合处理组显著降低

二、m7GTP pull-down实验检测依维莫司和ARA014418对eIF4E和eIF4G之间相互作用的影响

依维莫司组、AR-A014418组、联合处理组eIF4G相对值均较DMSO组降低，且联合处理组下降最为明显；而4EBP1相对值又均较DMSO组增加，联合处理组增加最为明显；eIF4E相对值与DMSO组差异无统计学意义。见表2、图3。

表2 m7GTP pull-down实验检测依维莫司和AR-A014418对eIF4E和eIF4G相互作用的影响（±s）

表2 m7GTP pull-down实验检测依维莫司和AR-A014418对eIF4E和eIF4G相互作用的影响（±s）

注：n=3

组别 eIF4G 4EBP1 eIF4E DMSO组 1.00±0.06 1.00±0.08 1.00±0.09依维莫司组 0.72±0.04 1.98±0.16 1.07±0.07 AR-A014418组 0.67±0.05 2.32±0.17 1.04±0.11联合处理组 0.12±0.05 7.58±0.25 1.09±0.12

图3 m7GTP pull-down实验检测依维莫司和AR-A014418对eIF4E和eIF4G之间的相互作用的影响 1～4：分别为DMSO组、依维莫司组、AR-A014418组、联合处理组。与DMSO组相比，依维莫司和AR-A014418均可促进4EBP1的合成，抑制eIF4G的合成，且联合处理组对4EBP1的促进和eIF4G的抑制更显著

三、依维莫司和AR-A014418对A375细胞增殖的抑制作用

培养24 h时，与DMSO组相比，依维莫司、ARA014418、依维莫司联合AR-A014418均对A375细胞增殖有抑制作用，联合处理组的抑制作用最为明显；培养48 h时，与DMSO组相比，依维莫司、ARA014418、依维莫司联合AR-A014418依然对A375细胞增殖有抑制作用，联合处理组的抑制作用最为明显，且依维莫司和AR-A014418对细胞增殖的抑制随时间的延长而增强。见图4。

析因分析显示，24、48 h时依维莫司和ARA014418均对细胞增殖有抑制作用（依维莫司：F24h=117.69，F48h=397.629；AR-A014418：F24h=375.09，F48h=736.38；均P＜0.001）；依维莫司和 ARA014418对细胞增殖的抑制有交互作用（F24h=77.241，F48h=19.817，均P＜ 0.001），根据相加模型判断为正交互作用。

图4 依维莫司和AR-A014418对A375细胞增殖的抑制作用依维莫司和AR-A014418对A375细胞的增殖活性均有抑制作用，而联合处理组的抑制作用更为显著

图5 依维莫司和AR-A014418对A375细胞凋亡的促进作用 依维莫司和AR-A014418对A375细胞的凋亡均有一定的促进作用，联合处理组对A375细胞凋亡的促进作用更为显著

析因分析显示，依维莫司和AR-A014418均对4EBP1有明显的促进作用（F=139.2、258.4，均P＜0.001），且两者有交互作用（F=15.325，P＜ 0.001），根据相加模型判断为正交互作用。

依维莫司和AR-A014418均可抑制eIF4G的表达（F=217.5、352.4，均P＜ 0.001），且两者有交互作用（F=27.145，P＜ 0.001），根据相加模型判断为正交互作用。

四、依维莫司和AR-A014418对A375细胞凋亡的促进作用

细胞凋亡检测结果见图5，依维莫司和AR-A014418单独处理A375细胞24 h对其凋亡有一定的促进作用（凋亡率分别为14.28%±2.18%、14.57%±2.35%），联合处理时凋亡率为55.18%±6.27%。析因分析显示，依维莫司和AR-A014418均可促进A375细胞凋亡（F=86.006、88.146，均P＜0.001），且两者有交互作用（F=45.96，P＜0.001），根据相加模型判断为正交互作用。

讨 论

研究发现，eIF4E蛋白在黑素瘤临床组织标本中表达升高，且eIF4E蛋白的表达与黑素瘤的恶性程度呈正相关［9-10］；最近的研究发现，RAS/RAF/MEK/ERK信号通路的激活能通过抑制miR-768-3p的表达调控eIF4E蛋白表达，促进帽子依赖的翻译，从而促进黑素瘤细胞的增殖和存活［11］。因此，帽子依赖的翻译可以作为治疗黑素瘤的重要靶点。

我们发现联合使用mTORC1激酶抑制剂依维莫司和GSK-3β激酶抑制剂AR-A014418能够显著抑制4EBP1的磷酸化，而非磷酸化的4EBP1能够与eIF4G竞争性结合eIF4E，从而抑制eIF4F蛋白复合物的形成。我们随后采用m7GTP pull-down实验检测依维莫司和AR-A014418对eIF4E和eIF4G相互作用的影响，发现依维莫司和ARA014418均可促进4EBP1的合成，抑制eIF4G的合成，且联合处理组对4EBP1的促进和eIF4G的抑制更显著，从而抑制4EBP1磷酸化，促进4EBP1与eIF4E结合，抑制eIF4E和eIF4G之间相互作用，从而抑制eIF4F蛋白复合物的形成。由于eIF4F蛋白复合物能够通过细胞存活促进基因（如Mcl1、Bcl2和生存素等）的蛋白翻译起始，从而促进细胞存活［12］，因此我们使用依维莫司和AR-A014418联合处理黑素瘤细胞A375后检测细胞的存活和凋亡，发现能显著抑制A375细胞存活，促进A375细胞凋亡。生存素是肿瘤细胞中重要的凋亡抑制蛋白，研究表明，生存素蛋白的翻译受eIF4F蛋白复合物调控［13］。检测依维莫司和AR-A014418联合处理A375细胞后生存素蛋白的表达，发现与依维莫司或AR-A014418单独作用相比，联合使用能够显著抑制A375细胞中生存素蛋白的表达。

总之，本研究发现，依维莫司和AR-A014418联合使用可协同抑制4EBP1的磷酸化，进而抑制eIF4F蛋白复合物的形成，抑制帽子依赖的翻译，促进黑素瘤细胞的凋亡。这些研究结果提示，将来在临床用药中可以采用联合使用依维莫司和ARA014418的方式抑制黑素瘤，以增强雷帕霉素衍生物依维莫司的肿瘤杀伤效果，克服黑素瘤细胞雷帕霉素耐药性的产生。

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Everolimus together with AR-A014418 induces apoptosis of A375 melanoma cells

Chen Lan,Rong Dongyun,Wu Chunwei,Cao Yu
Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang 550001,China

ObjectiveTo evaluate effects of simultaneous inhibition of mammalian target of rapamycin complex 1（mTORC1）kinase and glycogen synthase kinase-3β（GSK-3β）on phosphorylation of 4E-binding protein-1（4EBP1）,cap-dependent translation,as well as survival and apoptosis of melanoma cells.MethodsCultured A375 cells were classified into several groups to be treated with dimethyl sulfoxide （DMSO group）,the mTORC1 kinase inhibitor everolimus at a concentration of 5 nmol/L （everolimus group）,the GSK-3β kinase inhibitor AR-A014418 at a concentration of 10 μmol/L （AR-A014418 group）,or 5 nmol/L everolimus and 10 μmol/L AR-A014418（combined treatment group）.After additional culture,Western-blot analysis was performed to measure protein expressions of phosphorylated 4EBP1 （p4EBP1）and survivin in A375 cells,m7GTP pull down assay to estimate interaction between eukaryotic initiation factor-4E （eIF4E）and eIF4G,cell counting kit 8 （CCK8）assay to evaluate cell proliferation,and flow cytometry to detect cell apoptosis.ResultsBoth everolimus and AR-A014418 had inhibitory effects on 4EBP1 phosphorylation and survivin expression.The expressions of p4EBP1-65 and survivin were both significantly decreased in the everolimus group（0.74±0.05 and 0.71±0.06 respectively）,AR-A014418 group（0.62±0.06 and 0.58±0.07 respectively）and combined treatment group （0.14±0.04 and 0.09±0.05 respectively）compared with the DMSO group（1.00±0.07 and 1.00±0.06,respectively,allP＜0.001）,with the most significant decrease observed in the combined treatment group.As m7GTP pull-down assay showed,the everolimus group,AR-A014418 group and combined treatment group all showed significantly lower relative expression levels of eIF4G（0.72±0.04,0.67±0.05 and 0.12±0.05 vs.1.00±0.06,allP＜0.001）,but significantly higher relative expression levels of 4EBP1（1.98±0.16,2.32±0.17 and 7.58±0.25 vs.1.00±0.08,allP＜0.001）than the DMSO group,and the combined treatment group showed the lowest eIF4G expression but highest 4EBP1 expression.After 24-hour culture,the proliferation of A375 cells was inhibited by 18.5%±1.3%in the everolimus group,19.8%±1.8%in the AR-A014418 group,and 61.2%±2.1%in the combined treatment group compared with the DMSO group,with the strongest inhibition noted in the combined treatment group.The inhibitory effects of everolimus and AR-A014418 on cell proliferation increased over time,and showed the same trend at 48 hours.Flow cytometry showed that the apoptosis of A375 cells was accelerated by the 24-hour treatments with everolimus and AR-A014418 alone or in combination,with the apoptosis rate being 14.28%±2.18%,14.57%±2.35%and 55.18%±6.27%in the everolimus group,AR-A014418 group and combined treatment group respectively,and the combined treatment showed the strongest accelerating effect.ConclusionThe combined treatment with everolimus and ARA014418 can evidently inhibit 4EBP1 phosphorylation and eIF4F complex formation in A375 cells,which then suppress cap-dependent translation and promote apoptosis of melanoma cells.

Melanoma,experimental;Apoptosis;Glycogen synthase kinase 3;Survivin;Everolimus;4E-binding protein-1;Cap-dependent translation

s:Cao Yu,Email:caoyu7099@163.com;Wu Chunwei,Email:1960746280@qq.com

曹煜，Email：caoyu7099@163.com；吴春维，Email：1960746280@qq.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.04.010

贵州省中药现代化专项项目（20125018）

Fund program:Modernization of Traditional Chinese Medicine Program of Guizhou Province（20125018）

2015-09-25）

（本文编辑：周良佳 颜艳）