常见毛囊细胞角蛋白在毛囊周期中的表达研究

燕荣帅 裴卓 马小艮, 张一鸣 李玉红

毛囊是具有周期性生长特性的一个特殊器官，在出生后，毛囊不断经历生长期、退化期和静止期的循环[1]。毛囊体积小，但结构复杂。纵切面观察毛囊由外向里分为漏斗部、峡部、茎部和球部，与表皮呈一定角度；横切面观察毛囊由外向内分为外根鞘、内根鞘和毛干，呈同心圆排列。毛囊由十几种细胞组成，除真皮乳头和黑素细胞外，均来源于上皮细胞[2]。角蛋白在上皮细胞中表达最多，因此，角蛋白在毛囊的周期进展中扮演着重要的角色。在人头皮毛囊，有散在的角蛋白表达研究的报道，但是并未系统研究其在毛囊周期中的表达情况[3]。小鼠毛囊周期和人毛囊周期的最大差异，在于其同步化，即一定时间段内，各毛囊处于同一毛囊周期阶段。根据文献报道，小鼠毛囊细胞中有细胞角蛋白5（cytokeratin 5，Krt5）、细胞角蛋白 6（cytokeratin 6，Krt6）、细胞角蛋白 10（cytokeratin 10，Krt10）、细胞角蛋白 14（cytokeratin 14，Krt14）、细胞角蛋白 15（cytokeratin 15，Krt15）、细胞角蛋白 19（cytokeratin 19，Krt19）的表达，但均缺乏整个周期中的系统研究。本文根据经典的毛囊分期方案[4]，选取了毛囊周期的几个典型时期，包括毛囊发育期（出生后 1 d）、生长期启动（出生后 29 d）、生长期（出生后7 d）、退化期（出生后 18 d）和静止期（出生后 56 d），检测前述角蛋白在毛囊细胞中的表达情况，对其进行分析，为阐明角蛋白在毛囊周期中的作用机制奠定基础，为毛囊再生及毛囊周期调控研究提供借鉴。

材料和方法

一、主要材料

1.实验动物：C57 BL/6小鼠购自陆军军医大学实验动物中心，并在实验动物中心进行饲养和实验。

2.伦理声明：实验中所使用的动物符合我国微生物的控制要求，实验设计、实验过程及动物处死方法，经过陆军军医大学实验动物福利伦理审查委员会审核，符合动物伦理和动物福利要求。实验动物生产许可证号为SCXK（渝）20170002，使用许可证号为SYXK（渝）20170002。

3.主要试剂及耗材：多聚甲醛，无水乙醇，二甲苯，石蜡，兔抗 KRT5、KRT6、KRT10、KRT14、KRT15、KRT19抗体（中国生工生物工程有限公司），封闭用羊血清，AF488标记羊抗兔二抗（美国赛默飞世尔科技有限公司，），枸橼酸盐缓冲液，PBS，DAPI（中国碧云天生物技术公司），抗荧光猝灭封片剂，防脱组织切片。

二、主要方法

1.动物标本获取：取 P1、P7、P18、P29、P56（出生后 1、7、18、29、56 d）的 C57BL/6 小鼠，腹腔注射1%戊巴比妥100 μl；约5 min后，小鼠进入麻醉状态，用剃毛器剃掉长出皮肤部分毛干，并用眼科剪剪掉未剃干净毛干；用眼科剪剪取1 cm2的方形全层皮肤；将皮肤标本在PBS中简单清洗后，在滤纸上摊开，修剪平整；标记好小鼠头尾后，置于新鲜配制的4%多聚甲醛中，一起置于4 ℃冰箱。

2.动物标本处理：取材组织块，经4%多聚甲醛过夜固定后，按以下顺序进行梯度脱水：50%乙醇2h→75%乙醇2 h→85%乙醇2h→95%的乙醇2h→100%乙醇Ⅰ1h→100%乙醇Ⅱ1h→二甲苯Ⅰ15 min→二甲苯Ⅱ15 min；将组织块置于预先融化的石蜡中浸泡4 h，石蜡包埋组织块，注意包埋方向垂直瓶底，在石蜡切片机上进行切片，切片厚度为 5 μm。

3.免疫荧光：取前面获取的切片，65 ℃烤片3 h；按一下顺序进行梯度水合：二甲苯Ⅰ15 min→二 甲 苯Ⅱ15 min→100%乙醇I 3 min→100%乙醇Ⅱ3 min→95% 的 乙 醇3 min→85 %乙醇3 min→75 %乙醇3 min→50 %乙醇3 min→PBS 3 min；切片置于柠檬酸缓冲液，微波炉高火煮沸5 min，低火维持5 min；自然冷却后取出，滴加稀释后（1 : 50）的一抗，4 ℃过夜；PBS冲洗，3 min×4 次；避光条件下，滴加AF488标记的二抗，室温孵育1 h；PBS冲洗，3 min×3次；滴加1 : 10000 稀释的 DAPI，室温孵育 10 min；PBS 冲洗后，用抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察，拍照。

结 果

一、Krt5在毛囊周期中的表达特征

在毛囊发育期（图1a），Krt5表达于毛囊漏斗部及毛母质细胞。在生长期（图1b），Krt5表达于外根鞘、内根鞘及毛母质细胞。在退化期（图1c），Krt5表达于尚未凋亡的毛囊外根鞘及内根鞘细胞。生长期启动（图1d），Krt5表达于所有的毛囊上皮结构，包括次级毛芽、隆突区及外根鞘细胞。在静止期（图1e），Krt5表达于所有的毛囊上皮结构，包括隆突区和外根鞘。在所有毛囊周期中，Krt5均表达于表皮的角质层及表皮细胞，而不表达于毛囊的毛乳头细胞；其表达模式均为细胞质表达，在细胞核内没有表达。

图1 正置荧光显微镜下观察Krt5在毛囊周期中的表达（×400）

二、Krt6在毛囊周期中的表达特征

在毛囊发育期（图2a），Krt6表达于毛囊外根鞘及内根鞘细胞，在毛母质细胞没有表达。在生长期（图2b），Krt6表达于外根鞘、内根鞘及毛母质细胞。在退化期（图2c），Krt6表达于尚未凋亡的毛囊外根鞘及内根鞘细胞。生长期启动及静止期（图2d、2e），Krt6仅在毛囊外根鞘细胞有表达，在次级毛芽细胞没有表达。在所有毛囊周期中，Krt6均表达于表皮的角质层，在表皮细胞没有表达，在毛囊的毛乳头细胞也没有表达；其表达模式均为细胞质表达，在细胞核内没有表达。

图2 正置荧光显微镜下观察Krt6在毛囊周期中的表达（×400）

三、Krt10在毛囊周期中的表达特征

在毛囊发育期（图3a），Krt10表达于毛囊毛母质、内根鞘及内根鞘前体细胞。在生长期（图3b），Krt10表达于毛囊毛母质、内根鞘及内根鞘前体细胞。在退化期（图3c），Krt10表达于尚未凋亡的毛囊内根鞘细胞。生长期启动（图3d），Krt10表达于毛囊次级毛芽和隆突区细胞。在静止期（图3e），Krt10表达于毛囊隆突区，但仅限于隆突区内侧靠近毛干部分。在所有毛囊周期中，Krt10均表达于表皮的角质层及除基底层以外表皮细胞，在毛囊的毛乳头细胞始终没有表达；其表达模式均为细胞质表达，在细胞核内没有表达。

图3 正置荧光显微镜下观察Krt10在毛囊周期中的表达（×400）

四、Krt14在毛囊周期中的表达特征

在毛囊发育期（图4a），Krt14表达于毛囊毛母质、内根鞘、外根鞘及内根鞘、毛干前体细胞。在生长期（图4b），Krt14表达于毛囊毛母质、内根鞘、外根鞘及内根鞘、毛干前体细胞。在退化期（图4c），Krt14表达于尚未凋亡的毛囊内根鞘、外根鞘及内根鞘、毛干前体细胞。生长期启动（图4d），Krt14表达于毛囊漏斗部、次级毛芽和隆突区下段。在静止期（图4e），Krt14表达于毛囊漏斗部和隆突区，以及毛囊中部的部分外根鞘。在所有毛囊周期中，Krt14均表达于表皮细胞和皮脂腺细胞，在毛囊的毛乳头细胞始终没有表达；其表达模式均为细胞质表达，在细胞核内没有表达。

五、Krt15在毛囊周期中的表达特征

在毛囊发育期（图5a），Krt15表达于毛囊隆突区细胞。在生长期（图5b），Krt15表达于毛囊隆突区及毛母质以上部分的外根鞘细胞。在退化期（图5c），Krt15表达于毛囊隆突区及毛母质以上部分的外根鞘细胞。生长期启动（图5d），Krt15表达于毛囊次级毛芽和隆突区细胞。在静止期（图5e），Krt15表达于毛囊隆突区细胞。在所有毛囊周期中，Krt15均表达于表皮细胞，在毛囊的毛乳头细胞始终没有表达；其表达模式均为细胞质表达，在细胞核内没有表达。

图4 正置荧光显微镜下观察Krt14在毛囊周期中的表达（×400）

图5 正置荧光显微镜下观察Krt15在毛囊周期中的表达（×400）

六、Krt19在毛囊周期中的表达特征

在毛囊发育期（图6a），Krt19表达于毛囊隆突区。在生长期（图6b），Krt19表达于毛囊隆突区及毛母质以上部分的外根鞘细胞。在退化期（图6c），Krt19表达于毛囊隆突区及毛母质以上部分的外根鞘细胞。生长期启动（图6d），Krt19表达于毛囊次级毛芽和隆突区细胞。在静止期（图6e），Krt19表达于毛囊隆突区细胞。在所有毛囊周期中，Krt19均表达于基底层表皮细胞，在毛囊的毛乳头细胞始终没有表达；其表达模式均为细胞质表达，在细胞核内没有表达。

图6 正置荧光显微镜下观察Krt19在毛囊周期中的表达（×400）

讨 论

角蛋白是不溶性的纤维状动物蛋白质，是外胚层细胞的结构蛋白。基细胞由生长层移向表层成为角质化细胞的过程中，不断分泌角蛋白，且含量逐渐增加[5]。在毛囊的结构维持中，角蛋白发挥着重要作用[6]，角蛋白甚至还参与肿瘤的发生[7]。因此，对角蛋白的研究一直是毛囊相关研究的重点[8]。在人的毛囊中，已有常见角蛋白的表达研究报道[9]。然而，在鸟类、啮齿类动物中，却仅有散在报道[10]。因为人的标本获取困难，小鼠是最常见的研究模型。角蛋白在毛囊周期进程中也发挥着重要作用[11]，因此，对小鼠毛囊周期中角蛋白的表达情况研究显得非常重要，可以为毛囊周期调控研究提供重要的数据支持。在毛囊研究中Krt5和Krt14常被作为毛囊结构蛋白，显示整个毛囊的上皮结构[12-13]。本研究结果显示，在生长期和退化期Krt5和Krt14几乎表达于所有的毛囊上皮细胞，它们可以用于显示毛囊结构；但是，在毛囊发育期和静止期，Krt5和Krt14仅表达于部分毛囊上皮细胞，并不能用于显示毛囊结构。Krt6常被用作毛囊结构蛋白，显示毛囊内根鞘[14-15]；本研究结果提示，在毛囊周期的各个时期的内根鞘中均有Krt6的表达，因此，该蛋白适合显示毛囊的内根鞘细胞。和Krt6一样，Krt10也常被用作毛囊结构蛋白，显示毛囊的内根鞘；本研究结果提示，Krt10在毛囊发育期的毛球部均表达，在生长期启动的次级毛芽也表达，而毛球部和次级毛芽结构中主要是一些前体细胞，而不是已经分化的内根鞘细胞，所以Krt10并不适合显示这两个时期的内根鞘。Krt15和Krt19常被用作表皮干细胞和毛囊干细胞的标记物[16-17]，用于干细胞研究[18]。研究证明，毛囊干细胞栖息于毛囊皮脂腺下方的隆突区。本研究结果提示：在静止期，Krt15和Krt19均仅在毛囊隆突区表达，可以作为很好的毛囊干细胞标记物；在生长期启动，Krt15和Krt19除了在毛囊隆突区表达外，还在次级毛芽表达，因此，表达这两个角蛋白的细胞除了毛囊干细胞外，还有一些毛囊前体细胞和毛囊祖细胞；在生长期和退化期，Krt15和Krt19除了表达于隆突区外，还在毛囊下段的外根鞘表达，因此，表达这两个角蛋白的细胞除了毛囊干细胞外，还有一些已分化的毛囊外根鞘细胞，因此，Krt15和Krt19并不适合作为毛囊干细胞标记物，用于这两个时期的毛囊干细胞。对于Krt15作为毛囊干细胞标记物的合理性，以前也有报道提出质疑[19]，与本研究结果一致。

总之，本文系统研究了常见毛囊角蛋白在小鼠毛囊周期中的表达特征，与既往研究相比，发现了过去使用中的一些误区，供以后研究小鼠毛囊周期借鉴。包括：Krt5不适合作为毛囊发育期、生长期和退化期的毛囊上皮细胞标记物、Krt14不适合作为毛囊发育期和静止期的毛囊上皮细胞标记物、Krt10不适合毛囊发育期和毛囊生长期启动的毛囊内根鞘细胞标记物、Krt15和Krt19不适合毛囊生长期和退化期的毛囊干细胞标记物。所检测的几种角蛋白作为毛囊结构或毛囊干细胞标记物仅适用于特定的毛囊周期。因此，研究者在使用毛囊角蛋白作为标记物时，应首先明确其在毛囊周期中的表达情况。当然，本研究的结论还需要更多的实验来验证。可以考虑从以下两方面进行进一步研究：一方面，本研究仅研究了这些角蛋白的蛋白表达情况，将来可以进一步研究这些角蛋白的mRNA原位表达情况，并与蛋白水平进行比较；另一方面，本研究仅使用了一家公司的抗体，对每个角蛋白也仅使用了一个抗体进行研究，将来可以使用其他公司或针对其他表位的抗体进行研究，抗体的不同也有可能得出不同的结果。