产玫瑰红色素粘质沙雷氏菌的分离鉴定及抑菌活性

董　婷，景　波，2，李　伟，黄晓雅，钱俏君，杨　慧，潘康成，2，*

(1. 四川农业大学 动物医学院 动物微生态研究中心，四川 成都 611130；2. 动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130)



产玫瑰红色素粘质沙雷氏菌的分离鉴定及抑菌活性

董婷1，景波1，2，李伟1，黄晓雅1，钱俏君1，杨慧1，潘康成1，2，*

(1. 四川农业大学 动物医学院 动物微生态研究中心，四川 成都 611130；2. 动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130)

旨在分离鉴定产玫瑰红色素菌株，及其分离菌株和色素对病原菌的生物拮抗作用。经形态观察、生理生化试验和16S rRNA序列分析对其进行鉴定，通过控制变量法确定最佳产色素的温度及光照条件，破裂菌体提取色素分析此菌株产色素的量和红色素的性质，采用滤纸片法研究对病原菌的拮抗作用。结果表明：(1)分离细菌Dse-01菌株最终鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)；(2)该菌在25～35 ℃条件下培养色素形成较早且颜色较深，30 ℃温度下产色素最佳，光照对其色素形成时间没有明显影响；(3)30 ℃ 150 r·min-1培养24 h，提取获得色素粗品确定为灵菌红素，产量达(567.90±7.77)mg·L-1；(4)分离菌株的全菌液、上清液、菌体和提取色素对病原性大肠杆菌、沙门氏菌均无拮抗作用，而全菌液、菌体和提取色素对金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用。

粘质沙雷氏菌；灵菌红素；生物拮抗

色素在人们生产生活中被广泛应用。色素可分为天然色素和合成色素，由于合成色素营养价值低、有毒副作用，而天然色素具有色调自然、安全性好、营养价值较高和药理作用明显等特点，而日益受到重视和青睐。天然色素主要从动植物材料和微生物细胞中提取，色素价格昂贵，应用受到限制，而利用微生物生产天然色素，资源丰富，易于工业化生产，因此，采用微生物生产天然色素逐渐成为其来源的主要途径。目前，天然色素产生菌主要有红曲霉菌属(红曲色素)、微球菌属(粉红色、橘红色或红色色素)、假单胞菌属(水溶性蓝绿色素)和沙雷氏菌属(灵菌红素)等[1]。灵菌红素族色素(prodigiosins，PGs)是一类含甲氧基吡咯骨架结构的天然红色素，是由多种微生物如微球菌、弧菌、沙雷氏菌、假单胞菌等产生的次级代谢产物[2-5]。研究表明，灵菌红素具有抗菌、抗疟疾、抗肿瘤、免疫调节等作用[6-8]，尤其对多种肿瘤细胞有显著的抑制作用，而对正常细胞不具有毒性，并且在非细胞毒性作用浓度下能够抑制癌细胞的浸润，表现为抗癌细胞转移的作用，有望成为一种新型的抗肿瘤和抗肿瘤转移药物[9]。因此，本试验拟从发霉并具有玫瑰红颜色的玉米芯分离产玫瑰红色素的菌株，根据细菌形态特征、生理生化试验，结合16S rRNA 序列分析鉴定分离菌，研究该菌色素的产量及其生理学功能，为该菌应用于生产实际奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1待分离材料

长有红色斑点的玉米芯，采自四川省雅安市雨城区四川农业大学试验农场。

1.1.2培养基

麦芽汁琼脂培养基：取一定量的麦芽粉，用4倍量的水(50～60 ℃)调浆，然后在恒温水浴箱中(55～63 ℃)糖化3～5 h。煮沸后用两层纱布过滤，制得麦芽汁，调pH 值为5.0～6.0，加2%琼脂，121 ℃灭菌20 min。配制肉汤培养基不加琼脂即可。

营养琼脂培养基(NA)：蛋白胨1%，NaCl 0.5%，牛肉浸膏0.3%，琼脂2%。配制肉汤培养基不加琼脂即可。

1.1.3主要试剂

TE缓冲液(10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol·L-1EDTA，pH 8.0)；细菌裂解液(200 mmol·L-1NaCl，100 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，2.0% SDS，50 mmol·L-1EDTA，1.0%Triton X-100)；DL2000 DNA Marker；6×DNA Loading Buffer；250 μmol·L-1dNTP Master Mix(each)；10×PCR Buffer等PCR反应体系所需试剂均为宝生物工程(大连)有限公司产品。蛋白酶K，Amresco公司产品；溶菌酶，上海伯奥生物科技有限公司产品；RNase，Sigma公司产品；核酸染料Green View，天根生化科技(北京)有限公司产品；电泳级琼脂糖，BioRule产品。

1.1.4主要仪器

PCR仪及紫外凝胶成像系统(BIO-RAD Laboratories，USA)，电泳仪和电泳槽(北京六一仪器厂)，紫外分光光度计(WFZ UV-2100型，上海尤尼柯仪器有限公司)，高速冷冻离心机(Sigma 3K15)。

1.2方法

1.2.1菌株的分离纯化

选取长有玫瑰红斑点的玉米芯，破碎后，加入10倍量的灭菌生理盐水，30 ℃室温150 r·min-1震荡3 h，接种环蘸取稀释液并画线接种于NA琼脂平板上，28，30 ℃恒温需氧培养24，48 h，观察平板中的菌落情况。挑取产玫瑰红色素的单一菌落(株)画线接种于NA琼脂培养基上，30 ℃需氧培养24 h，如此重复3次，获得纯化的菌株，纯化后的菌株接种于营养琼脂斜面培养基，30 ℃需氧培养24 h，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2产玫瑰红色素菌株的初步鉴定

参考有关细菌鉴定手册[10]对分离纯化的细菌进行形态和生理生化特性的初步鉴定。

1.2.316S rRNA基因序列分析

将纯化菌种接种于营养肉汤中，30 ℃ 150 r·min-1振荡培养12 h，取1.5 mL菌液置于EP管中，5 000g离心5 min，收集菌体，参照文献[11]的方法提取细菌基因组DNA。利用细菌的16S rRNA 通用正反向引物(P1)5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，(P2)5’-GG TTACCTTGTTACG-ACTT-3’，以提取的基因组DNA为模板进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。反应体系(15 μL)为：7.5 μL Mix，P1和P2各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O 4.5 μL。PCR 程序为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 50 s，60 ℃ 90 s，72 ℃ 60 s，25个循环；72 ℃ 延伸10 min。

PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，若出现1.5 kb左右的单一条带，则证明已成功扩增目标16S rRNA序列。将PCR产物寄往上海美吉生物有限公司测序，然后将得到的16S rRNA序列提交到NCBI核酸数据库中进行BlAST在线比对，之后从NCBI的GenBank核酸数据库中随机选取报道中的部分细菌16S rRNA序列，应用MEGA 5.2软件进行多序列比对，并构建系统发育树，最终确定菌株的进化分类地位。

1.2.4温度和光对菌株产玫瑰红色素的影响

将分离纯化得到的菌株，画线接种于营养琼脂平板上，分别置于20，25，30，35，40 ℃温度下，分别在完全遮光、昼夜交替光照条件下需氧培养24，36，48 h，观察菌落颜色并照相。

1.2.5产玫瑰红色素量的分析

将纯化菌种接入营养肉汤中，30 ℃ 150 r·min-1培养12 h，再以此培养液为种子，按5%的接种量接入营养肉汤中，根据1.2.4节的方法试验结果，选择培养温度和光照条件，150 r·min-1培养24 h，2 300g离心15 min，收集沉淀。灭菌蒸馏水洗涤沉淀，离心，重复3 次，收集沉淀。加入2倍于菌体重量的无水乙醇抽提，辅以超声波破碎，4 ℃ 92g离心5 min，收集上清液，重复多次抽提直至菌体无颜色。合并上清液，经低温浓缩干燥至恒重，得色素粗品，称重，计算其产量。

1.2.6玫瑰红色素性质分析

上述无水乙醇抽提菌体并离心获得的上清液，在280～600 nm波长范围内测定吸光度，绘制吸收光谱图。

1.2.7菌株及提取的色素对病原细菌的生物拮抗作用

将纯化菌种接入营养肉汤中，30 ℃ 150 r·min-1培养24 h，2 300g离心 5 min，收集上清液，沉淀物用灭菌生理盐水洗涤2次，灭菌生理盐水复原至培养液体积。称取1.2.3节提取的色素6 mg，用0.2 mL 二甲亚砜(DMSO)溶解，然后加入9.8 mL灭菌生理盐水稀释。在培养物全菌液、上清滤、菌体复原液、色素稀释液中加入灭菌并干燥的滤纸圆片(Φ=6 mm)浸泡3 h。病原性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌接种于营养肉汤中37 ℃ 150 r·min-1培养18 h，测定病原菌培养物的浓度并用灭菌生理盐水调节至106cfu·mL-1。取0.1 mL病原菌稀释液涂布于营养琼脂平板，待干后，放置充分吸胀的滤纸圆片于营养琼脂平板上，平衡2 h后，放入30 ℃需氧培养24，48 h，观察有无抑菌圈并测量其直径。

2　结果

2.1产玫瑰红色素菌株的分离及细菌形态特点的观察

从长有红色斑点的玉米芯中分离得到一株产玫瑰红色素细菌，编号为DSe-01。纯化后菌株画线接种于营养琼脂平板上30 ℃培养24 h，菌落呈玫瑰红色，但色素不扩散到培养基中，菌落不透明、表面光滑、球状凸起、黏稠状(图1-A)。细菌革兰氏染色呈阴性，菌体短杆菌，端圆，无芽孢(图1-B)。

2.2分离细菌Dse-01菌株的生理生化特征

产玫瑰红色素分离细菌Dse-01菌株为革兰氏阴性短杆菌(图1-B)，好氧，V-P阳性，吲哚、M.R(MethylRedtest，甲基红试验)反应阴性；能利用蔗糖、葡萄糖、甘露醇、肌酸、枸橼酸盐产酸，有的产气；不能利用乳糖、尿素、木糖、阿拉伯糖(表1)。结合细菌的形态特征，初步鉴定该菌为沙雷氏菌属的细菌。

2.316S rRNA基因序列分析

以提取的细菌基因组DNA为模板，P1和P2为引物进行PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，获得一条长约1 400 bp的扩增产物。将PCR产物寄往上海美吉生物有限公司测序，测序所得的Dse-01菌株的16S rRNA序列长度为1 406 bp。将得到的序列提交到NCBI数据库中进行在线比对，Dse-01菌株在前100个命中的基因序列中有83个命中了沙雷氏菌属，有48个确切命中了粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)其中与SerratiamarcescensMSSRF QS71菌株相似性达100%。从NCBI的GenBank核酸数据库中选取部分细菌16S rRNA序列，应用MEGA 5.2软件进行多序列比对，并构建系统发育树(图2)，从图可见，分离细菌Dse-01菌株与粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)距离最近，进一步分析分离细菌Dse-01菌株与两株Serratiamarcescens(GenBank登录号分别为JQ308606.1，KJ877659.1)的遗传距离为0，与沙雷氏菌属的其他菌种遗传距离为0.022～0.032，与肠杆菌科其他3个代表种遗传距离为0.035～0.038。结合上述细菌的形态、生理生化特性和16S rRNA序列分析，最终确定分离细菌Dse-01为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。

A： 菌落特征； B： 菌体细胞形态。图1　DSe-01菌株的形态特征Fig.1　The morphological characters of Dse-01 strain

表1分离细菌Dse-01的生理生化特征

Table 1Physiochemical properties of Dse-01 strain

特征模式菌Dse-01菌株特征模式菌Dse-01菌株V-P++海藻糖++吲哚--阿拉伯糖--甲基红试验--乳糖--苯丙氨酸脱氨酶--明胶液化++氧化酶--棉籽糖--DNA酶++鼠李糖--硫化氢++木糖--枸橼酸盐++甘露醇++甘露糖++肌醇++葡萄糖++D-山梨醇++麦芽糖++水杨苷++蔗糖++卫矛醇--

注：+表示阳性，-表示阴性。

2.4温度和光照对DSe-01菌株产色素的影响

不同温度及昼夜光照条件下菌株的生长、形成玫瑰红色素的状况见图3。从图可知，温度对分离细菌Dse-01菌株菌落颜色有明显的影响，20 ℃培养形成玫瑰红色素时间延迟，而40 ℃条件下培养，菌株几乎不产色素。25～35 ℃条件下培养，色素形成较早且颜色较深，其中30 ℃温度下培养产玫瑰红色素最佳；遮光和未遮光(自然光照)培养，对分离细菌Dse-01产色素没有明显的影响。结果表明，分离细菌Dse-01菌株发酵或培养生产玫瑰红色素不需要专门的遮光培养，产色素的培养最佳温度是30 ℃。

2.5Dse-01菌株玫瑰红色素的产量

Dse-01菌株接种营养肉汤后，30 ℃ 150 r·min-1培养24 h，提取色素，获得色素粗品，经计算其产量为(567.9±7.77)mg·L-1。

2.6色素的吸收光谱分析

无水乙醇提取的浸提液，在280～600 nm波长范围内测定吸光度，吸收光谱见图4。由图可知，无水乙醇浸提获得的色素在波长535 nm处有最大吸收峰。

2.7拮抗试验结果

注：菌种名后为登录号。图2　Dse-01菌株的16S rRNA系统进化树Fig.2　Phylogenetic tree of Dse-01strain based on the 16S rRNA sequence

图3　培养温度和光照对粘质沙雷氏菌Dse-01产色素的影响Fig.3　Effect of temperature and illumination on the producing pigment of Serratia marcescens Dse-01

图4　色素的紫外可见光吸收光谱Fig.4　Ultraviolet visible absorption spectrum of pigment

粘质沙雷氏菌发酵培养液(全菌液)、离心上清液、沉淀洗涤后的菌体及提取色素对病原性大肠杆菌、沙门氏菌和金色葡萄球菌的生物拮抗结果见表2。由表2可见，粘质沙雷氏菌发酵培养液、菌体及提取色素对革兰氏阴性的大肠杆菌、沙门氏菌均无抑制作用，而对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用，发酵培养的离心上清液对3株病原性细菌均无抑制作用。

表2粘质沙雷氏菌Dse-01及色素对3株病原性细菌的生物拮抗试验(Φ mm)

Table 2Antagonism ofSerratiamarcescensDse-01 and pigment on 3 strains of pathogenic bacteria (Φ mm)

细菌全菌液上清液菌体色素大肠杆菌0000沙门氏菌0000金色葡萄球菌11.11±0.01012.88±0.0013.65±0.00

3　讨论

本试验从具有红色斑点的废弃玉米芯中分离得到一株产玫瑰红色素菌株，通过对其菌落形态和细菌形态特征的观察、生理生化特征进行初步鉴定，结合16S rRNA序列分析，最终确定分离细菌Dse-01菌株为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。有大量的研究证实，一些粘质沙雷氏菌的菌株为条件致病菌，常引起人的角膜炎、关节炎、泌尿道感染、肺炎等，尤其是免疫力低下的住院患者引起院内感染[12-14]，但研究者认为造成感染的沙雷氏菌是一些耐药的部分菌株，而能产色素的粘质沙雷氏菌一般都是非致病性菌株[15-16]。

粘质沙雷氏菌的一些菌株能产生灵菌红素，是该类细菌的一个显著特点，其培养产生色素受温度的影响非常大，粘质沙雷氏菌的生长温度范围在20～40 ℃，而合成灵菌红素的温度范围一般在24～28 ℃，其最适产灵菌红素的温度为28 ℃，而高于37 ℃则产灵菌红素受到抑制[1，17]。本试验分离得到的粘质沙雷氏菌Dse-01在平板培养过程中，其产玫瑰红色素受温度影响明显，20 ℃培养色素形成时间推后，40 ℃条件下培养几乎不产色素，而在25～35 ℃条件下培养色素形成较早且颜色较深，其中30 ℃温度下培养产玫瑰红色素最佳，这一结果与前人的研究结果相似；本试验发现，遮光和未遮光培养，对Dse-01菌株色素形成没有明显的影响，这一结果与王飞等[18]研究在黑暗条件下培养粘质沙雷氏菌有利于其生长和色素产生的结果有所不同，本研究结果提示应用Dse-01菌株发酵或培养生产玫瑰红色素不需要专门的遮光培养设备。

大量的研究表明，粘质沙雷氏菌所产的灵菌红素在中性和酸性条件，在200～800 nm 的波长范围内具有特异性吸收峰，峰值在535 nm处[2，7-8，12]。本试验分离的粘质沙雷氏菌Dse-01经摇瓶培养后，无水乙醇提取的色素溶液在波长535 nm处有最大吸收峰值，这一结果表明，Dse-01菌株所产的玫瑰红色素为灵菌红素。抑菌活性是灵菌红素的生物活性之一，本试验发现，粘质沙雷氏菌培养全菌液、上清液、菌体及提取色素溶液对病原性大肠杆菌、沙门氏菌均没有抑菌活性，与周围报道从粘质沙雷氏菌提取的灵菌红素对大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌等多株临床病原细菌均无显著抑制作用是一致的[20]，但本试验结果表明，分离的粘质沙雷氏菌全菌液、菌体及色素溶液对金色葡萄球菌具有明显的抑制作用，与周围报道的结果灵菌红素对金黄色葡萄球菌无显著抑制作用不同[20]。推测其原因，可能是被测菌株、提取及测试灵菌红素的方法差异等所致。

4　结论

本试验从具有红色斑点的玉米芯中分离得到一株产玫瑰红色素菌株，经鉴定为粘质沙雷氏菌，所产色素为灵菌红素，在30 ℃条件下培养，色素形成较早且颜色较深，光照对其产色素无明显影响。粘质沙雷氏菌和提取的色素溶液对金色葡萄球菌具有明显的抑制作用，但对大肠杆菌和沙门氏菌没有抑制作用。

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(责任编辑卢福庄)

Isolation， identification and antibacterial activities of Serratia marcescens producing rosy pigment

DONG Ting1， JING Bo1,2， LI Wei1， HUANG Xiao-ya1， QIAN Qiao-jun1， YANG Hui1， PAN Kang-cheng1，2，*

(1.ResearchCenterofAnimalMicroecology，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，Chengdu611130，China)

This experiment was conducted to isolate and identify a microbial strain producing rosy pigment， and to study its antibacterial activity. The microbial strains were identified by morphological characteristics， physiochemical properties and 16S rRNA gene sequence analysis. The optimization of temperature and illumination condition for rosy pigment production was investigated by variable-controlling approach. Ultrasonic fragmentation was used to extract pigment and analyze its yield and absorption spectrum. In eventually， antagonism assay to pathogens also be carried out by filter-paper method. The results showed that: (1) a screened strain Dse-01 was identified asSerratiamarcescens; (2) The strain showed significant impact on chromogenesis under the condition of 25-35 ℃， especially at 30 ℃， which was not affected by illumination; (3) The strain was cultured at 30 ℃ for 24 h with a shaking speed of 150 r·min-1and the extracts was prodigiosin， whose production could reach (567.90±7.77) mg·L-1; (4) the pathogenicEscherichiacoliandSalmonellaspp. were resistant to four active substance:Serratiamarcescens， sediment ofSerratiamarcescens， supernatant ofSerratiamarcescensand pigment extraction fromSerratiamarcescens， whereas，Staphylococcusaureuswas sensitive to all of these active products except the supernatant.

Serratiamarcescens; prodigiosin; biological antagonism

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.02.12

2015-08-25

“教育部长江学者和创新团队发展计划”创新团队资助项目(IRT0848)；四川农业大学教学改革研究项目(X2011008)

董婷(1993—)，女，新疆伊宁市人，2012级生物工程专业本科生。E-mail: 15983541397@163.com

，潘康成，E-mail：pankangcheng71@126.com

S816.79；Q939.92

A

1004-1524(2016)02-0252-07

董婷，景波，李伟，等. 产玫瑰红色素粘质沙雷氏菌的分离鉴定及抑菌活性[J].浙江农业学报，2016，28(2): 252-258.